多胺在番茄响应低温胁迫中的作用

李海燕，邹 兰

(咸阳市农业科学研究院，陕西 咸阳 712034)

多胺(PAs)广泛存在于生物细胞中，是生物代谢产生的一类有生物活性的脂肪族含氮碱，主要包括腐胺(Put)、亚精胺(Spd)和精胺(Spm)[1]。PAs能够提高作物对盐害、干旱、冷害、低氧等环境胁迫的耐受性[2～3]。Tun在药理学上的研究表明，PAs能诱导NO的产生[4]。有研究证实，PAs和NO两种信号物质之间存在联系，例如都参与了防御病原菌的反应、响应非生物胁迫及调节植物衰老等。本试验以番茄幼苗为材料，通过测定NO、H2O2含量及NR、NOS活性，探讨低温胁迫下PAs与NO的关系，并为PAs诱导植物细胞合成一氧化氮提供证据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

试验于2019年春季在西北农林科技大学科研基地日光温室中进行。试验番茄为“Moneymaker”。2019年3月15日播种，浸种催芽，选取发芽一致的种子播于穴盘，以草炭、蛭石、珍珠岩按2∶1∶1配基质。4月10日分苗至10 cm×10 cm的塑料钵中，保持相同温度和浇水量。在番茄五叶一心时，选取长势相同的苗子放入人工气候室，昼温25℃，夜温15℃。低温处理温度为4℃，设置4个处理，分别喷施1mmol Put、Spd、Spm 以及H2O(作为对照)，分别在0、12、24 h以及缓苗10 h(25℃下)取样。

1.2 测定内容与方法

1.2.1 NO含量的测定 称取0.5 g番茄幼苗叶片，加入1 mL浓度为0.05 mol·L-1，pH=7.4，含有1%PVP的磷酸缓冲液，在冰上研磨成匀浆状并转移到离心管，再用1 mL缓冲液冲洗研磨壁，离心10 min(4℃，1 200 r·min-1)，取1mL上清液于1.5 mL离心管中备用，按照测试盒说明书来测定NO含量。

1.2.2 硝酸还原酶(NR)活性测定 采用活体法测定：称取叶片0.5 g，加入试管中，对照先加入1 mL30%三氯乙酸溶液，然后再加入0.1 mol·L-11的KNO3溶液9 mL，抽气1 h，置于25℃下暗反应30 min，然后加入1 mL 30%三氯乙酸溶液，吸上清液1 mL于新试管中，加入2 mL 1%磺胺溶液和2 mL 0.02%萘胺溶液，显色20 min，于540 nm下比色。

1.2.3 一氧化氮合酶(NOS)活性测定 NOS测定的磨样方法与NO基本相同，匀浆离心20 min(0℃，15 000r·min-1)，为保护NOS活性应尽快测量，或放入-20℃保存，按照NOS测试盒说明书测定含量。

1.2.4 H2O2含量的测定 H2O2测定参照Prochazkova等(2001)的方法[6]，称取2 g番茄幼苗叶片冷冻样，加8 mL预冷丙酮研磨，取1.0 mL研磨液与0.1 mL硫酸钛及0.2 mL浓氨水混合，12 000×g离心10 min，用丙酮洗涤沉淀3次以上，用硫酸溶解后415 nm比色，后进行0～20μmol·L-1H2O2—丙酮的标样测定。

2 结果与分析

2.1 多胺对低温胁迫下番茄幼苗叶片NO含量的影响

由图1可见，低温处理前各处理间NO含量基本相同；Put预处理后，与对照相比，NO含量均基本不变；Spd和Spm预处理后，低温处理12 h和24 h时，NO含量高于对照且差异显著，预处理后缓苗10h时NO含量与对照基本相同。由此可以看出，对于不同种类多胺，外源Spd和Spm预处理对低温下番茄幼苗叶片NO含量有明显影响，而Put预处理对低温胁迫下NO含量无明显影响。

2.2 多胺对低温胁迫下番茄幼苗叶片NR活性的影响

由图2可见，低温处理前各处理间硝酸还原酶(NR)活性差异均不显著；与对照相比，Put预处理后，低温处理和缓苗后番茄幼苗叶片NR活性基本不变；Spd和Spm预处理后，低温处理12 h和24 h时，NR活性高于对照且差异显著，预处理后缓苗10 h时NR活性与对照基本相同。由此可以看出，对于不同种类多胺，外源Spd和Spm预处理对低温胁迫下番茄幼苗叶片NR活性有影响，且Spm的效果更为明显，而Put预处理对低温胁迫下NR活性无明显影响。

2.3 多胺对低温胁迫下番茄幼苗叶片NOS活性的影响

由图3可见，低温处理前各处理间一氧化氮合酶(NOS)活性差异均不显著；与对照相比，Put预处理后，低温处理和缓苗后NOS活性基本维持不变；Spd和Spm预处理后，低温处理12 h和24 h时，NOS活性明显升高且差异显著，预处理后缓苗10h时NOS活性与对照基本相同。由此可以看出，对于不同种类多胺，外源Spd和Spm预处理对低温胁迫下番茄幼苗叶片NOS活性有显著影响，而Put预处理对低温胁迫下NOS活性无明显影响。

2.4 多胺对低温胁迫下番茄幼苗叶片H2O2活性的影响

由图4可见，低温处理前各处理间H2O2含量差异均不显著；与对照相比，Put预处理后，低温处理和缓苗后H2O2含量基本维持不变；Spd和Spm预处理后，低温处理12 h和24 h时，番茄幼苗叶片H2O2含量明显升高且差异显著，预处理后缓苗10 h时H2O2含量与对照基本相同。由此可以看出，对于不同种类多胺，外源Spd和Spm预处理对低温胁迫下番茄幼苗叶片H2O2含量有明显影响，且Spm的效果更加明显，而Put预处理对低温胁迫下H2O2含量无明显影响。

2.5 CAT预处理下多胺对番茄幼苗叶片NO含量的影响

由图5A可见，外源添加过氧化氢酶(CAT)作为过氧化氢清除剂对番茄幼苗进行预处理24 h，然后喷施Spd，低温处理12 h和24 h时，NO含量比未进行CAT预处理显著降低，喷施Spm能达到相同的效果(图5B)，喷施Put时NO含量差异不显著(图5C)。由此可以看出，在低温胁迫下，CAT对番茄幼苗叶片NO产生了抑制作用，而CAT是植物体内H2O2的清除酶，因此可以推断出，多胺诱导NO的产生与H2O2有着某种关联，当H2O2的产生受到抑制时，会影响植物体内NO的含量，所以H2O2可能作为上游信号物质来影响NO含量。

3 讨论

PAs作为第二信使参与植物的逆境胁迫响应。NO也是植物对抗一些生物和非生物逆境胁迫防御反应机制的关键信号分子参与植物体内多种生理代谢，包括促进生长、延缓衰老、促进种子萌发、诱导细胞程序性死亡和防御相关基因表达[7～8]。Tun等人研究表明，PAs能诱导产生NO。笔者试验结果表明，与CK相比，低温胁迫下Spd和Spm处理显著增加了番茄幼苗叶片NO的含量，而Put处理的效果不明显，进一步证实了PAs能诱导产生NO 的说法。

植物体有酶催化和非酶催化二种途径合成NO。有氧条件下主要靠NR途径合成NO，NADH把电子传给NO2-，还原产生NO。正常条件下，植物体内含很少NO2-，研究显示，植物在缺光或缺氧下会产生大量NO2-。植物正常生长时，细胞中NO含量较低，在遇到逆境时，NO2-会被还原成NO，这可能是植物在逆境胁迫下产生NO的原因[9]。试验结果也表明了，低温胁迫下，Spd和Spm处理会显著增加番茄幼苗叶片NR和NOS的活性，而Put处理没有明显效果，这进一步可以证明多胺能诱导产生NO。

研究表明，H2O2可以作为重要的信号分子参与植物一些生理活动的调控，并与其他一些信号分子之间有着密切关系。H2O2产生可能处于NO合成的上游，研究表明NO的合成依赖于H2O2的产生[10]。也就是说H2O2可促进NO的合成，同时一定浓度下的NO又能提高H2O2的水平，两者之间有着密切关系。本试验结果表明，低温胁迫下，Spd和Spm显著提高了番茄幼苗叶片H2O2的水平，从而进一步提高了NO的水平。试验结果还表明，外源添加过氧化氢清除剂(CAT)后，Spd和Spm处理过的番茄幼苗叶片NO含量显著下降，这为H2O2可以提高NO的水平的猜想提供了有力证据。

4 结论

低温胁迫下，多胺能够诱导NO的合成，基本途径有三个，通过NR和NOS的酶催化途径生成NO，以及通过H2O2作为信号分子诱导产生NO。

(1)逆境胁迫下，Spd和Spm能够诱导NO的合成，而Put作用不明显。

(2)逆境胁迫下，Spd和Spm处理会显著增加番茄幼苗叶片NR和NOS的活性，而Put处理没有明显效果，说明多胺诱导下植物体可以通过NR和NOS酶催化途径来合成NO。

(3)逆境胁迫下，Spd和Spm处理时植物体中H2O2含量显著升高，外源添加过氧化氢清除剂(CAT)后，Spd和Spm处理的番茄幼苗叶片NO含量显著下降，H2O2可以作为重要的信号分子来诱导NO的合成。