入侵福建的草地贪夜蛾的分子鉴定

王亚如　蔡香云　庄家祥　侯有明

摘要 草地贪夜蛾是世界粮农组织预警的重大迁飞性害虫。2019年1月被发现入侵我国，并迅速在我国扩散蔓延，在我国玉米种植区造成重大经济损失。本文利用线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（COⅠ）和位于Z染色体上的磷酸丙糖异构酶（Tpi）基因的分子标记对采集于福建地区的84份草地贪夜蛾进行群体遗传特征分析，结果显示，基于COⅠ仅在南平邵武和南平建阳两个地区鉴定到3份玉米型，其他81份均为水稻型;基于Tpi基因的检测结果，84份样品在174和175碱基处存在“AT”“GA”或“AT/GA”3种不同类型，但均为玉米型。福建省为亚热带季风气候区，玉米终年都有种植，草地贪夜蛾可在该省越冬，本研究基于COⅠ和Tpi两个基因片段的分子标记进行草地贪夜蛾两种亚型的分子鉴定，为热带与南亚热带地区草地贪夜蛾的迁入迁出虫源监测预警提供了依据，为该入侵害虫遗传溯源积累了前期数据。

关键词 草地贪夜蛾; 水稻型; 玉米型; 分子标记; 入侵害虫

中图分类号： S 435.132

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020138

Molecular identification of Spodoptera frugiperda invaded in Fujian province

WANG Yaru1， CAI Xiangyun1， ZHUANG Jiaxiang2， HOU Youming1*

（1. State Key Laboratory of Ecological Pest Control for Fujian and Taiwan Crops，

Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China;

2. Fujian Plant Protection and Plant Quarantine Station， Fuzhou 350003， China）

Abstract

Spodoptera frugiperda is a major migratory pest that FAO has warned about it. It invaded China in January 2019 and spread rapidly， causing significant economic losses in Chinas corn planting areas. In this study， the molecular markers of mitochondrial cytochrome C oxidase subunitⅠ（COⅠ） and triose phosphate isomerase （Tpi） located on the Z chromosome were used to analyze the population genetic characteristics of 84 S.frugiperda samples collected from Fujian province. The results showed that only 3 samples from Shaowu and Jianyang of Nanping county were identified as corn strain， and the other 81 samples were identified as rice strain by COⅠ gene. When using Tpi gene as marker， though three gene types including “AT” and “GA” or “AT/GA” at  position 174 and 175 were identified， all samples were corn strain. Fujian province belongs to subtropical monsoon climate area， and corn is planted all year round. S.frugiperda can overwinter here. This study used two molecular markers， COⅠand Tpi to identify the biotypes of S.frugiperda. The results provided a basis for the monitoring of the source of fall armyworms in tropical and southern subtropical regions， and accumulated preliminary data for the genetic tracing of the invasive pest.

Key words

Spodoptera frugiperda; rice strain; corn strain; molecular marker; invasive insects

草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda （J.E.Smith）俗称秋黏虫（fall armyworm），是夜蛾科Noctuidae灰翅夜蛾属Spodoptera的一种杂食性、迁飞性、检疫性农业害虫[1]，可对农作物造成毁灭性破坏。其原产于美洲的热带和亚热带地区，寄主植物350多种，主要寄主为玉米和水稻。自2019年1月入侵我国后，草地贪夜蛾已扩散至我国20多个省（直辖市、自治区）[2]，为害玉米[3]、小麦[4]、花生[5]等作物，尤其是玉米种植区，因草地贪夜蛾为害已造成无法挽回的经济损失。

草地贪夜蛾成虫迁飞能力极强，据报道其成虫在风向合适时每晚可迁飞100 km[6]。草地贪夜蛾发源于美洲，于2016年入侵非洲，两年内非洲40多个国家都监测到其入侵。由于取食的寄主植物不同，草地贪夜蛾分化出了两种亚型——R型（rice strain， 水稻型）和C型（corn strain， 玉米型）[7]，目前两种亚型草地贪夜蛾已在非洲定殖为害。这两种亚型的草地贪夜蛾群体对寄主的趋向性和在不同寄主植物上的适应性不同[8-10]，不同亚型的草地贪夜蛾在对转基因植物的抗性表现[11-12]、农药抗性[13-14]、迁飞行为[15-16]等方面也存在差异。但是这两种亚型在形态上无法区分，因此需要对两种寄主型的草地贪夜蛾开展分子鉴定，主要手段是分子标记，其中来源于线粒体的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因（COⅠ）以及位于Z染色体上编码磷酸丙糖异构酶的基因（Tpi）是当前最常用的标记基因[17-19]。目前，针对入侵我国各省份的草地贪夜蛾的遗传鉴定也主要使用COⅠ和Tpi分子标记[20-24]，结合这两种分子标记更能厘清草地贪夜蛾的遗传特性。

福建省为亚热带季风气候区，终年都有玉米种植，草地贪夜蛾可在该省越冬，增加了该虫的防治难

度。本研究基于COⅠ和Tpi两个基因片段的分子标记对福建地区（福州、厦门、漳州、莆田、泉州、南平、三明等7市10县/区）的草地贪夜蛾进行了分子

鉴定，对了解该入侵物种的遗传结构以及制定有效

预测预警防控策略具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫采集

本研究的草地贪夜蛾样本来源于福建省福州闽侯洋里新见村、福州闽侯大湖村、漳州长泰陈港镇石室村、南平顺昌县水口寨村、漳州长泰陈港镇西湖村、莆田仙游游洋镇梧椿村、厦门同安、南平建阳、三明永安、泉州惠安等10个地区（图1） 的玉米田，共计84份，其中幼虫为玉米田人工采集所得，成虫为玉米田性诱剂诱捕所得，具体样本信息见表1。样品带回实验室后立即冻于液氮，备用。

1.2 DNA提取和PCR扩增

采用CTAB法分别提取单头幼虫或成虫的DNA。单头虫体置于研钵中加液氮研磨成粉末，于2 mL离心管中抽提DNA，经1%琼脂糖电泳检测后用作PCR扩增模板。用于COⅠ和Tpi分子标记的引物见表2。应用TaKaRa Ex Taq试剂盒进行PCR扩增。反应体系：10×Ex Taq buffer 5 μL，dNTP mixture 4 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，Ex Taq酶0.25 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反应程序：94℃预变性3 min;94℃变性30 s， 58℃（COⅠ）或49℃（Tpi） 退火30 s，72℃延伸30 s， 35个循环;72℃延伸5 min; 12℃保存备用。使用2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段特异性后切胶回收，并将PCR产物连接到pMDTM 19-T载体上。每个样品各挑取4个克隆由生工生物工程（上海）股份有限公司完成测序。

1.3 序列分析

序列测定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，并利用SeqMan和BioEdit软件对正反向测序序列进行人工拼接及峰图校正获得的准确的COⅠ和Tpi基因片段序列。针对已报道的基于COⅠ和Tpi基因序列的水稻型和玉米型单倍型特点，参考从GenBank数据库发布的草地贪夜蛾COⅠ和Tpi基因序列分别进行差异位点分析，进而确定本研究中草地贪夜蛾的亚型。

2 结果与分析

对所采集的福建省10个县（区）的84份样品利用标记COⅠ基因进行序列比对，分析其寄主型，结果（图2）显示，除南平邵武（NPSW）的2个样本（NPSW-2和NPSW-7）和南平建阳（NPJY-6）的1个样本的序列与已报道的草地贪夜蛾玉米型（HM136586）的序列一致外，其他包括这两个地区在内的81份样品的序列与已报道的草地贪夜蛾水稻型（HM136593）序列一致，但本研究所采集样本的寄主均为玉米，说明由COⅠ标记鉴定得到的寄主型与样品来源的寄主型并不一致，但能够鉴定出其与其他物种的区别。而Tpi基因序列的比对分析结果显示，10个地区的样本序列均与已报道的玉米型序列特征相符合（图3），但部分样本第174和175碱基为“AT”或“GA”，即存在174和175碱基处为“AT”或“GA”两种基因型。本研究检测的84份样品中53份样本只存在“AT”位点，11份样本只存在“GA”位点，其他20份样本的4个TA克隆子至少存在一条为“AT”位点（其他几条为“GA”位点）或“GA”位点（其他几条为“AT”位点），总体来说基于Tpi基因的序列分析显示所有样品均为玉米型，与其寄主型相符。

3 结论与讨论

自2019年1月草地贪夜蛾入侵我国至今已一年，據农业农村部和各地植保人员的观察统计，草地贪夜蛾主要对我国玉米生产造成严重的经济损失，但也在其他农产品植物上偶有发现，如：甘蔗[26]、花生[5]、甘蓝[27]等，草地贪夜蛾在我国的定殖与扩散正值关键期，对其生态学、生物学、生理学特点及其在其他潜在寄主植物上的为害特点的研究对其防治尤其重要。

本研究通过COⅠ和Tpi基因分子标记对采自福建地区10县（区）的84份草地贪夜蛾样品的单倍型进行了分析，结果显示，基于COⅠ的鉴定结果，3.57%的样本为玉米型，96.43%的样本为水稻型;而基于Tpi的鉴定结果显示所有样本均为玉米型。本文的研究结果与张磊等[21]的中国不同地区草地贪夜蛾种群生物型分子特征分析结果（基于线粒体COⅠ基因96%以上为水稻型，玉米型所占比例不到4%，基于Tpi基因分析结果表明所有样品为玉米型）是一致的;与徐丽娜等[22]的入侵安徽省草地贪夜蛾的遗传分析结果（基于COⅠ基因安徽省草地贪夜蛾样本86.23%是水稻型，13.77%是玉米型，基于Tpi基因所有样品为玉米型）也基本一致;Nagoshi等[28]2018年对采自非洲的样本的检测结果也是如此。导致两种分子标记的鉴定结果不一致的原因可能是ZW型性别决定机制的草地贪夜蛾的COⅠ是线粒体基因，为母系遗传，但Tpi基因位于Z染色体，且两种亚型的草地贪夜蛾之间并不存在绝对的生殖隔离[29]。该结果也说明了入侵福建地区的草地贪夜蛾也许存在不同路径，即侵入南平地区的草地贪夜蛾和福建其他几个地区的草地贪夜蛾入侵路径不同，这与前人关于草地贪夜蛾入侵我国可能存在不同路径[30-31]的研究结果是一致的。

草地贪夜蛾作为联合国粮农组织（FAO）全球预警的迁飞害虫，近年来被广泛研究。由于玉米型与水稻型之间不存在绝对的生殖隔离，田间交叉杂交导致了草地贪夜蛾的遗传复杂性，Nagoshi等[32-33]的研究表明，西半球的草地贪夜蛾根据COⅠ单倍型频率的不同玉米型草地贪夜蛾又可细分为“FL型”和“TX型”，根据Tpi单倍型位点的不同玉米型草地贪夜蛾可细分为“Tpi-Ca1型”（MG603702）、“Tpi-Ca2型”（MG603703）和“Tpi-CaH型”[28]。单一种群的长期近交容易造成遗传衰退，而草地贪夜蛾拥有极强的迁飞能力，这可能也是导致其遗传复杂性的外在原因之一。目前国内的许多研究表明侵入我国的草地贪夜蛾主要为杂交型[20-23]，理论上可能存在杂交优势，但草地贪夜蛾入侵我国仅一年，本地种还未完全形成，现阶段依然是防治草地贪夜蛾的关键时期。

本研究综合COⅠ和Tpi两个分子标记的检测结果表明，入侵福建地区的草地贪夜蛾94%以上是水稻型母本与玉米型父本杂交后代演化而来的杂合玉米型草地贪夜蛾。由于水稻型与玉米型草地贪夜蛾的抗药性[13-14]、遷飞性[15-16]、寄主趋向及适应性不同[1，8-9]，水稻型和玉米型又不存在绝对的生殖隔离，故理论上存在进化出水稻型的可能。福建省为亚热带季风气候区，玉米、水稻、甘蔗等作物终年均有种植，是草地贪夜蛾天然适宜的定殖与越冬地，所以对草地贪夜蛾的发生与迁飞动态需要更多的关注。本研究对草地贪夜蛾展开分子鉴定有助于分析其来源、了解其遗传特性、发生动态等，同时为当前我国处于起步阶段的草地贪夜蛾群体遗传研究积累理论数据，为指导防控提供科学信息。

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（責任编辑：王 音）