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响应面法优化中药乌贼墨酶解工艺及体外抗肿瘤活性研究

2020-08-25陶然刘富菁王娅玲

当代化工 2020年5期
关键词:水溶性乌贼多糖

陶然 刘富菁 王娅玲

摘      要:以水溶性总蛋白及总多糖双指标优化中药乌贼墨酶解法提取工艺并进行了体外抗肿瘤活性研究。以中药乌贼墨总蛋白、总多糖为指标,采用单因素实验,分别考察酶解时间、加酶量和酶解pH值对双指标的影响,在此基础上,应用响应面试验设计法优化中药乌贼墨酶解提取工艺,最后在最佳酶解提取工艺的条件下,采用MTT法对酶解物冻干粉进行体外抗肝癌Bel-7402细胞株的实验研究。结果最佳工艺条件为:酶解时间4.50 h,加酶量为2 500 u,pH为10.6;在此条件下,乌贼墨水溶性总蛋白的得率最高为38.34%,水溶性总多糖的得率最高为12.26%。最佳条件下制得的乌贼墨酶解液对肝癌Bel-7402细胞株有一定的抑制作用,抑制率达到70%~80%。通过响应面法优化乌贼墨酶解工艺条件,使水溶性总蛋白及总多糖得率增加,为乌贼墨活性成分及抗肿瘤研究奠定基础。

关  键  词:乌贼墨;酶解;响应面法;水溶性总蛋白;水溶性总多糖;肝癌Bel-7402细胞株

中图分类号:R282.77       文献标识码: A       文章编号: 1671-0460(2020)05-0855-05

Abstract: The extraction process of squid ink was optimized, and the antitumor activity in vitro was studied. Taking the total protein and total polysaccharide of squid ink as indexes, the effect of hydrolysis time, amount of enzyme and PH value of hydrolysis on the two indexes was investigated by single factor experiment. On this basis, the extraction process of squid ink was optimized by response surface design. Finally, under the optimum conditions of enzyme hydrolysis and extraction, MTT method was used to study the effect of lyophilized powder of enzyme hydrolysate on liver cancer Bel-7402 cell line in vitro. The optimum conditions were determined as follows: the hydrolysis time 4.50 h, the amount of enzyme 2 500 u, and the pH 10.6. Under these conditions, the highest yield of water-soluble total protein was 38.34%, and the highest yield of water-soluble total polysaccharide was 12.26%. Under the optimum conditions, the squid ink hydrolysate could inhibit the liver cancer Bel-7402 cell line to a certain extent, and the inhibition rate was 70%~80%. After the enzymatic hydrolysis conditions of squid ink were optimized by response surface method, the yield of water-soluble total protein and total polysaccharide was increased, which laid a foundation for the study of active components and antitumor activities of squid ink.

Key words:Squid ink; Enzymolysis; Response surface method; Water soluble total protein; Water soluble total polysaccharide; Liver cancer cell line Bel-7402

乌贼墨存在于乌贼的墨囊中,由黑色素和蛋白多糖复合体组成,其蛋白质和糖类的含量分别为6.3%、3.0%。现代研究表明,乌贼墨中的多糖、蛋白质、多肽等活性物质均具有良好的抗肿瘤、抗氧化等作用。酶解技术在中药有效成分提取中具有明显优势,其可在温和的条件下提高中药有效成分的浸出率,保证药物有效成分的药效[1]。同时酶可使蛋白质、糖蛋白等成分水解成小分子活性肽或多糖类物质,从而有效地发挥其药理作用。酶的催化能力受pH值、酶解温度等因素的影响较大,因此对于特定药物,研究酶反应的最佳条件尤为重要[2]。在前期实验研究中,我们仿照人体胃肠道的环境和运行原理,已经明确了乌贼墨最佳的酶解温度为37 ℃、最佳的用酶为胰蛋白酶[3]。本次实验首先采用单因素方法,分别考察酶解时间、加酶量和酶解pH值对乌贼墨中总蛋白、总多糖提取率的影响,在此基础上,应用响应面试验设计法优化中药乌贼墨酶解提取工艺,最后在最佳酶解提取工艺的条件下,采用MTT法对酶解物冻干粉进行体外抗肝癌Bel-7402細胞株的实验研究。

1  试剂与仪器

胰酶细胞消化液、RPMI Medium 1640培养基、牛血清蛋白、胰蛋白酶(上海源叶生物科技有限公司);葡萄糖、福林酚、浓硫酸(国药集团化学试剂有限公司);FA1204B型分析天平(上海天美天平仪器有限公司);KQ-500GVDV双频恒温数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);DNM-9602酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司);乌贼墨(SepiellamaindronideRochebrune)冻干粉经山东中医药大学高德民副教授鉴定为正品。

2  方法及结果

2.1  乌贼墨酶解液的制备工艺流程

乌贼墨→冻干制粉→精密称取1.000 g→加40倍蒸馏水溶解→超声提取(80 Hz)30 min→调节pH→加胰蛋白酶→37 ℃酶解→3 000 r·min-1、4 ℃离心10 min→抽滤、定容至100 mL→稀释至适宜浓度→水溶性总蛋白质、水溶性总多糖含量测定。

2.2  水溶性总蛋白及水溶性总多糖含量测定

采用改良lowry法[4],Y = 2.267 5X+ 0.003 9, R2 = 0.998 4,测定蛋白质含量。采用苯酚-硫酸法[5],Y= 13.484X+ 0.007 2,R2 = 0.998 8,测定多糖含量。(Y吸光度值;X:标准溶液浓度)。

2.3  单因素试验考察乌贼墨酶解工艺

多糖与蛋白质均为乌贼墨酶解液中的主要有效成分。以水溶性总蛋白质、水溶性总多糖为双指标,分别探讨酶解过程中酶解时间、加酶量、pH对各指标的影响。设定各指标的权重系数均为1,提取工艺优化过程中,先算出水溶性总多糖及总蛋白得率,再按公式进行标准化处理,得综合评价值[6]。

2.3.1  酶解时间对水溶性总多糖及总蛋白得率影响

酶解时间分别选取2、3、4、5、6、7、8 h,固定pH调至8.0,酶活力为2 000 u。由图1可知,随着酶解时间的延长,可提高蛋白质和多糖溶出,在2~8 h内,酶解液中总多糖及总蛋白质得率均先升高后降低。在2~4 h内,蛋白质得率不断提升,因为随时间延长,酶与药液充分酶解,4~8 h内呈现先缓慢升高后平缓下降的趋势,并且在6 h达到最大值。多糖得率的变化不如蛋白质明显,总体呈现缓慢上升后得率逐渐稳定的趋势,并于4 h达到最大值。根据水溶性总蛋白质及多糖的得率,结合综合评价值,选择3、4、5 h进行工艺优化。

2.3.2   pH对水溶性总多糖及总蛋白得率的影响

pH分别调至6、7、8、9、10、11、12,固定酶解时间为4 h,酶活力为2 000 u。由图2可知,pH的变化对蛋白质、多糖得率影响均较大。随着pH的不断提升,总蛋白得率先升高趋于平衡后下降,并于pH值为10时得率最高。在pH为6~10之间总蛋白质得率增长迅速,pH为10~12范围内呈现先趋于平衡后下降趋势,可见碱性条件有利于蛋白质的溶出。在pH为6~12之间总多糖的得率呈现先升高后下降的趋势,在pH值为10时总多糖的得率达到最大。根据水溶性总蛋白质及多糖的得率,结合综合评价值,选择pH为9、10、11进行工艺优化。

2.3.3  酶活力对水溶性总多糖及总蛋白得率的影响

分别加胰蛋白酶1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 u,固定酶解时间为4 h,pH为8.0。由图3可知,在试验范围内,总多糖得率随酶活力增加呈现先升高后降低的趋势,在酶活力为2 500 u时多糖得率达到最大。蛋白质得率在酶活力为1 000~1 500 u呈现上升趋势,在2 000~3 000 u范围内呈现先下降后趋于平衡。根据水溶性总蛋白质及多糖的得率,结合综合评价值,选择酶活力1 500、2 000、2 500 u进行工艺优化。

2.4  响应面法设计优化乌贼墨酶解工艺[7]

2.4.1  响应面法实验结果与分析

在单因素试验的基础上,采用响应面中心组合试验设计优化提取乌贼墨水溶性总多糖及水溶性总蛋白的工艺参数。以水溶性总蛋白得率(Y1)及水溶性总多糖得率(Y2)为指标,考察酶解时间(A)、pH(B)、酶活力(C)对制备工艺的影响。采用Design-Expert8.0.6软件对数据进行统计分析(以P<0.05作为判断显著性的标准),见表1-2。

根据表3、4方差分析所示,本实验所选用的二次多项模型具有显著性(P<0.05),失拟项的P值为0.555 5、0.210 7,均表现为不显著,表明该回归模型理想。用方程Y1和Y2拟合3个因素(酶解时间、pH、酶活力)与水溶性总蛋白及总多糖得率之间的关系是可行的。对于水溶性总蛋白得率(Y1),其决定系数R2为0.998 0,校正决定系数R2adj为0.995 5,说明该模型能解释99.55%响应值。对于水溶性总多糖得率(Y2),其决定系数R2为0.984 5,校正决定系数R2adj为0.964 6,说明该模型能解释96.46%响应值。

表3的方差分析结果表明,A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2对水溶性总蛋白得率(Y1)影响显著,即时间、pH、酶活力3因素均对水溶性总蛋白得率有显著影响,交互作用时间与酶活力影响最显著。表4的方差分析结果表明,A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2对水溶性总多糖得率(Y2)影响显著,即时间、pH、酶活力三个因素均对水溶性总多糖得率(Y2)有显著影响,交互作用时间与酶活力对水溶性总多糖得率有显著影响。上述结果表明响应值的变化相当复杂,各个试验因素对响应值的影响呈二次关系,且各因素之间有相互影响。

2.4.2  各因素對响应面值的影响

如图4所示,在实验范围内,水溶性总蛋白质得率及水溶性总多糖得率均随着酶解时间、pH、酶活力的增加呈现先增加后下降的趋势,说明这3个因素均有最佳值。

2.4.3  最佳酶解工艺验证

通过Design-Expert8.0.6软件,得到最优工艺为酶解时间4.5 h,pH值为10.6,酶活力为2 500 u,此时水溶性总蛋白质理论得率为33.64%,水溶性总多糖理论得率为11.24%。

按照选取的最佳工艺条件重复3次试验,得到平均水溶性总蛋白得率为38.34%,水溶性总多糖得率为12.26%,实验结果与最佳工艺预测值接近,说明该工艺稳定可靠。

2.5  MTT法测定乌贼墨酶解产物对肝癌Bel-7402细胞株的抑制作用

采用MTT法进行体外抗肿瘤实验研究[4],通过测定细胞抑制率可以反映药物对细胞增殖的影响。图5为最佳工艺条件下的乌贼墨酶解液对肝癌Bel-7402细胞株的抑制率,由图可知,在药物浓度0.2~0.8 mg·mL-1范围内,细胞抑制率均为超过50%,在药物浓度0.8~0.1 mg·mL-1之间,细胞抑制率持续上升,在药物浓度1.0 mg·mL-1时,细胞抑制率达到73.85%。在药物浓度1.0~2.0 mg·mL-1范围内,细胞抑制率在67%~77%之间波动。

3  结论

乌贼墨作为传统中药,主要用于止血。随着近代研究发现其具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌等活性,具有丰富的营养价值与药用价值,但乌贼墨作为乌贼的副产品,目前并未得到充分利用。乌贼墨的主要成分是黑色素、黑素蛋白、蛋白多糖复合体,黑色素中还含有次生降解低聚糖,但黑色素的水溶性较差,可溶于碱性溶液,在酸性环境会产生沉淀[8]。而胰蛋白酶为酸蛋白酶,最适pH值为7.8~8.5左右,碱性过强强会使酶的活性降低。因此、考察pH对酶解工艺的影响尤为重要。通过酶解可使黑素蛋白、糖蛋白等物质水解为小分子活性肽和糖类物质,从而提高活性成分的溶出,增加其药理活性。

文中采用半仿生-酶解法,在37 ℃用胰蛋白酶酶解乌贼墨,以水溶性总蛋白质及水溶性总多糖的得率为指标,在单因素试验基础上,通过响应面试验优化,得最佳酶解工艺为:酶解时间4.5 h、 pH为10.6、酶活力2 500 u。体外药理实验研究表明,经胰蛋白酶酶解后的乌贼墨酶解液可以在体外抑制肝癌Bel-7402细胞株的生长。

参考文献:

[1]于敬,周晶.生物酶解技术在中药提取中的应用[J]. 现代药物与临床,2010, 25 (5): 340-344.

[2]韩章远,韩永龙,孟祥乐. 酶解技术在中药提取中的应用进展[J]. 广州化工,2009,37(6):12-14.

[3]陶然,刘金虎,毛会秀,等.基于半仿生酶解技术的中药乌贼墨最佳用酶初步筛选[J]. 当代化工,2019, 48 (4): 738-741.

[4]史磊,刘春雨,张盼盼. 正交實验法优选发酵蜈蚣粉中水溶性总蛋白提取工艺及其抗肿瘤效果[J]. 山东中医杂志,2017, 36 (8): 710-713.

[5]中国药典2015年版.一部[S]. 2015:283.

[6]秦超,容蓉,杨勇,等.多指标正交试验优选麻黄附子细辛汤提取工艺[J]. 中国实验方剂学杂志,2012,18 (9): 35-39.

[7]伍善广,冯学珍,蒙华琳,等. 双指标参数Box-Behnken响应面优化α-细辛脑脂质体制备工艺[J]. 中药材,2014, 37 (3): 504-507.

[8]杜铁平,周培根. 乌贼墨研究概况[J]. 食品研究与开发,2002, 23 (6):16-17.

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