基于响应面法的搅拌型褐色酸奶关键工艺优化研究

杨大明，李永鹏

（酒钢集团祁牧乳业有限责任公司，甘肃 嘉峪关 735100）

1 概述

褐色酸奶是近两年兴起的酸奶品类，其核心技术主要是长时间高温热处理，使得牛奶中的还原糖与蛋白质之间发生美拉德反应（Maillard reaction），再经发酵制成褐色并伴有焦甜风味的酸奶[1-2]。Arena等[3]指出乳制品中的美拉德反应产物是许多生物活性肽的来源，也是重要的风味物质，但乳品中的美拉德反应同样会产生晚期糖基化终产物（Advanced glycation end products，AGEs），这将不利于健康。 然而，Oh等[4]研究发现，褐色酸奶则能够抑制心血管疾病，前提是控制好美拉德反应与发酵的程度。此外，张俊山[5]以及白雪等[6]都研究了褐色酸奶的工艺优化，这些学者均采用了正交设计进行的工艺优化，并且发现褐色酸奶的褐变程度及发酵程度显著影响最终产品的感官评分水平。韩千慧等[7]则系统地研究了褐色酸奶的品质评价方法，并指出褐色酸奶是品质特征完全不同于普通酸奶的产品类型，因此其发酵工艺不能套用普通酸奶的现成工艺参数。刘婕等[8]将传统希腊酸奶改造为褐色酸奶，发现感官评价得分最高的工艺参数并不同于传统工艺。根据相关研究，新型酸奶在某些通用工艺方面有必要调节具体参数[9-15]。综上所述，传统酸奶制作工艺在向着褐色酸奶转化时，原有工艺条件并不一定适用，因而需要转化调节，这就需要进行生产工艺的优化设计。

甘肃祁牧乳业也于2016年底，开始引入凝固型褐色酸奶产品，并在2017年在初步工艺优化的基础上将该类产品开发成了搅拌型褐色酸奶，然而初级产品的口感及质地等品质尚有提高的空间。然而，由于受到原有实验室条件的限制，该工艺优化调整一直缺乏足够的基础。随着祁牧乳业研发团队的成立，相关硬件软件设施的完善，尤其是感官评价小组培训的完成，祁牧乳业研发团队逐渐具备了这样的工艺优化研究条件。因此，本文采用单因素和响应面设计结合的方式，以感官评价得分为依据，对搅拌型褐色酸奶的生产工艺进行了优化，从而形成最优工艺，以期为高品质产品生产提供理论及技术方案的依据。

2 试验材料和试验方法

2.1 试验原料

鲜牛奶，甘肃祁牧乳业有限责任公司；稳定剂（S-01型、DN-201 型、HBA-2L-5 型）， 河北百优生物科技有限公司；乳清蛋白粉（WPC-80），江苏普新生物科技有限公司；加糖炼乳；稀奶油；YO-MIX883型发酵剂，丹尼斯克（中国）有限公司。

2.2 试验设备

SW-CJ-ID型超净工作台，苏州净化设备有限公司；EMS-30型磁力搅拌水浴锅，常州市人和仪器厂；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗机械厂；DNP-9082型电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；GJJ-0.5/25高压均质机，上海诺尼轻工机械有限公司。

2.3 工艺流程及关键控制参数分析

2.3.1 褐色酸奶工艺流程

原奶→标准化→添加辅料（稳定剂）→预热、均质→杀菌→褐变→配料 （蔗糖与葡萄糖）→杀菌→接种→发酵→搅拌破乳→灌装→检验→冷却后熟→成品。

2.3.2 品质关键控制参数分析

1）蔗糖与葡萄糖比例：蔗糖主要贡献于产品的甜度，葡萄糖则是乳酸菌发酵利用的最主要的来源，两者只有达到一个平衡时，才能保证最终产品发酵程度和甜味之间形成最佳的甜酸比例，达到最佳口感。

2）总糖添加量：加糖不足则甜味和发酵程度达不到要求，加糖量过多则会引起过甜的感觉，因此总糖添加量必须控制在适当水平。

3）稳定剂种类：目前祁牧乳业供货商主要提供3种现成的稳定剂，根据已经形成的标准化生产模块，其添加量均为0.5%，其具体型号分别为S-01型、DN-201型、HBA-2L-5型，究竟哪一种更适用于褐色酸奶还有待进一步研究。

4）褐变温度：美拉德反应只有在温度达到一定程度后才可能发生，而且温度对于产物的影响很大，因此最佳风味物质的产生于温度范围密切相关。

5）褐变时间：根据研究，美拉德反应产物的累积直接相关于反应时间，链式反应的终端产物不但风味较差，而且不利于健康[3]，因此适宜的反应时间对于良好风味的形成关系密切。

6）发酵温度：发酵温度要适合微生物最适宜的生长温度，过热或过冷均会产生应激反应而产生不良风味。

7）发酵时间：发酵时间决定了最终产品的酸度以及黏稠度，是影响产品的关键因素。

8）冷却后熟时间：由于受生产条件的限制，后熟的温度只能采用与常规冷库一致的4℃，冷却时间就成为了影响后熟风味形成的关键因素。

2.4 试验设计

2.4.1 单因素实验设计

通过分析，祁牧乳业可供改进的搅拌型褐色酸奶品质关键控制点共有8个，这8个关键控制点的暂定工艺参数为：蔗糖与葡萄糖比例5:5，总糖添加量6%，稳定剂为HBA-2L-5型，褐变温度92℃，褐变时间270min，发酵温度 42℃，发酵时间 8h，冷却后熟时间为24h。其他工艺参数为现有标准化生产条件，具体包括杀菌温度85℃、杀菌时间15s、接种量0.025%、配料温度65℃、稳定剂添加量0.5%、乳清蛋白粉添加量0.5%、稀奶油添加量0.5%，搅拌破乳速度10r/min，不具备调整的可能性。针对上述7个可调控的关键控制参数进行单因素实验设计（重复数n=3），以感官评价为依据，选择最佳工艺点。

1）蔗糖与葡萄糖比例：蔗糖与葡萄糖的总糖添加量选择为6%，稳定剂选择HBA-2L-5型，褐变温度控制为92℃，褐变时间控制为210min，发酵温度控制为42℃，发酵时间控制为8h，冷却后熟时间为24h。蔗糖与葡萄糖比例则分别选择 2:8、4:6、5:5、6:4、8:2。制成成品以后根据感官评价结果确定最佳比例。

2）总糖添加量：蔗糖与葡萄糖比例选择为5:5，稳定剂选择HBA-2L-5型，褐变温度控制为92℃，褐变时间控制为210min，发酵温度控制为42℃，发酵时间控制为8h，冷却后熟时间为24h。总糖添加量分别选择4%、6%、8%、10%、12%。制成成品以后根据感官评价结果确定总糖添加量。

3）稳定剂种类：蔗糖与葡萄糖比例选择为5:5，总糖添加量选择6%，褐变温度控制为92℃，褐变时间控制为210min，发酵温度控制为42℃，发酵时间控制为8h，冷却后熟时间为24h。稳定剂分别选择S-01型、DN-201型、HBA-2L-5型。制成成品以后根据感官评价结果确定稳定剂种类。

4）褐变温度：蔗糖与葡萄糖比例选择为5:5，总糖添加量选择6%，稳定剂选择HBA-2L-5型，褐变时间控制为210min，发酵温度控制为42℃，发酵时间控制为8h，冷却后熟时间为24h，褐变温度分别控制为 91℃、92℃、93℃、94℃、95℃。 制成成品以后根据感官评价结果确定褐变温度。

5）褐变时间：蔗糖与葡萄糖比例选择为5:5，总糖添加量选择6%，稳定剂选择HBA-2L-5型，褐变温度控制为92℃，发酵温度控制为42℃，发酵时间控制为8h，冷却后熟时间为24h，褐变时间分别控制为 120min、180min、210min、240min、270min。 制成成品以后根据感官评价结果确定褐变时间。

6）发酵温度：蔗糖与葡萄糖比例选择为5:5，总糖添加量选择6%，稳定剂选择HBA-2L-5型，褐变温度控制为92℃，褐变时间控制为210min，发酵时间控制为8h，冷却后熟时间为24h，发酵温度分别控制为 40℃、41℃、42℃、43℃、44℃。制成成品以后根据感官评价结果确定发酵温度。

7）发酵时间：蔗糖与葡萄糖比例选择为5:5，总糖添加量选择6%，稳定剂选择HBA-2L-5型，褐变温度控制为92℃，褐变时间控制为210min，发酵温度控制为42℃，冷却后熟时间为24h，发酵时间分别控制为 7h、8h、9h、10h、11h。 制成成品以后根据感官评价结果确定发酵时间。

8）冷却后熟时间：蔗糖与葡萄糖比例选择为5:5，总糖添加量选择6%，稳定剂选择HBA-2L-5型，褐变温度控制为92℃，褐变时间控制为210min，发酵温度控制为42℃，发酵时间分别控制为8h，冷却后熟时间分别控制为 24h、48h、72h、96h， 制成成品以后根据感官评价结果确定冷却后熟时间。

2.4.2 工艺参数的Box-Behnken响应面优化

从上述7个工艺参数中筛选出可变动的3～4个工艺参数，进行Box-Behnken响应面优化设计，筛选结果根据单因素试验结果而定。根据单因素实验结果，选取褐变时间（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）为响应面优化的3个因素，其因素水平见表1。

表1 Box-Behnken响应面优化设计因素水平表

2.5 感官评价得分

感官评分依据刘婕等采用的方法进行，并略作修改。随机选自12名食品专业人员对产品进行评定，对褐色酸奶按表2评定标准进行感官评定。感官评定时间为小组成员餐后2～4h，评定不同样品期间使用无盐饼干及纯净水来消除样品影响，以确保感官评价下组成员的感官敏感性。样品得分按照色泽、口感、气味、组织状态的各自权重给出总体评分（百分制），样品得分为评价小组成员各自得分中去除一个最高分、去除一个最低分以后的平均得分。

表2 褐色酸奶感官评分标准

2.6 数据统计与分析

所有数据采集与图表制作均使用Excel 2003软件来进行，单因素试验结果的方差分析采用SPSS19.0软件来进行，使用单因素模式，显著性差异P＜0.05。Box-Behnken响应面分析则采用Design Expert8.5软件来进行。

3 结果与讨论

3.1 单因素试验设计

3.1.1 蔗糖与葡萄糖比例

褐色酸奶在不同蔗糖与葡萄糖比例下的感官评价得分如图1所示。

图1 不同蔗糖与葡萄糖比例下褐色酸奶的感官评分

Buehler等[10]研究指出酸奶发酵过程中，虽然乳酸菌在利用乳糖发酵生长过程中具有优势，但是并不表示乳糖是酸奶发酵的唯一能量来源，葡萄糖是大多数微生物都能够利用的糖类。所以当葡萄糖比例较高时，可能会因为少量杂菌生长以及对于乳糖发酵的干扰，而产生异常的风味物质，所以会令褐色酸奶的感官评分下降。但只要不是葡萄糖水平过高，则不会产生这种情况。

由图1可知，蔗糖与葡萄糖比例为2:8时褐色酸奶的感官评分显著低于其他各组（P＜0.05），但当蔗糖比例高于这一水平时，褐色酸奶感官评分之间并没有显著差异（P＞0.05），因此蔗糖与葡萄糖比例可以沿用初始设计工艺中的5:5，沿用这一工艺可以在提高现有生产技术的集成程度。

3.1.2 总糖添加量

褐色酸奶在不同总糖添加量下的感官评价得分如图2所示。

图2 不同总糖添加量条件下褐色酸奶的感官评分

由图2可知，随着总糖含量的提升，褐色酸奶的品质呈现出显著提高的趋势（P＜0.05），但当总糖添加量达到8%以后则再无显著变化（P＞0.05）。这说明糖的增加可以显著改善褐色酸奶口感，但是当添加量达到8%以后这种改善作用就达到了极限。因此祁牧乳业褐色酸奶的糖添加量可以固定为8%。

3.1.3 稳定剂种类

褐色酸奶在使用不同稳定剂时，感官评价得分如图3所示。

图3 不同稳定剂条件下褐色酸奶的感官评分

由图3可知，用HBA-2L-5型稳定剂制作的褐色酸奶感官评分显著高于其他2种常用稳定剂（P＜0.05），因此祁牧乳业的褐色酸奶产品可以固定使用HBA-2L-5型稳定剂。

3.1.4 褐变温度

褐色酸奶在不同褐变温度条件下的感官评价得分如图4所示。

图4 不同褐变温度下褐色酸奶的感官评分

由图4可知，随着褐变温度的提高，褐色酸奶的感官评价也会逐渐提高。93℃和94℃褐变条件下的褐色酸奶感官评分没有显著差异（P＞0.05），均超过了72分，但却显著高于91℃和92℃褐变条件下褐色酸奶评分（P＜0.05）。当褐变温度达到95℃时的褐色酸奶评分显著高于其他各个温度，分数超过了77分。虽然理论上讲，也许当温度高于95℃时可以获得更高评分的褐色酸奶产品，但由于受到现有设备的限制，即使采用高温蒸汽加热的方式，95℃基本上也是现有设备的极限参数了，再要提高温度就可能超过现有设备对于蒸汽压力的安全要求，这是在不改变设备的前提下难以做到的，因此祁牧乳业褐色酸奶的褐变温度就固定为95℃。

Arena等[3]指出乳制品中的美拉德反应产物是重要的风味物质来源之一，而温度则是美拉德反应途径的重要影响因素，部分风味物质只有当温度超过一定条件时才会产生。所以本文所发现的试验现象，很有可能是因为随着温度的提升，一些具有独特香气的挥发性成分才会产生，所以温度越高也就越趋向于产生更高的评分。

3.1.5 褐变时间

褐色酸奶在不同褐变时间下的感官评价得分如图5所示。

图5 不同褐变时间下褐色酸奶的感官评分

由图5可知，随着褐变时间从120min不断增加到240min，褐色酸奶的感官评分逐渐升高，然而达到270min时突然下降。为了获取更加适合的褐变时间，该因素将进入Box-Behnken响应面优化设计环节。

3.1.6 发酵温度

褐色酸奶在不同发酵温度下的感官评价得分如图6所示。

图6 不同发酵温度下褐色酸奶的感官评分

由图6可知，当发酵温度为40℃时，所得褐色酸奶感官评分只有65分左右，而当发酵温度提升至42℃时，也就是祁牧乳业暂定的酸奶发酵温度，褐色酸奶评分超过了74分，显著高于40℃和41℃条件下发酵的褐色酸奶（P＜0.05）。发酵温度为43℃时，褐色酸奶感官评分达到了76.7分。当发酵温度超过44℃以后，褐色酸奶评分则显著下降，与40℃和41℃条件下时差异不显著（P＞0.05）。该因素可作为Box-Behnken响应面优化设计的因素之一。

Zhou 等[11]、He 等[12]以及 Fang 等[13]均研究了花色酸奶的工艺与产品特性，结果发现当在酸奶中引入其他风味及营养保健成分后，酸奶最适宜的发酵温度总会或多或少的发生变化。42℃与43℃同样可能是良好发酵条件，这可能与上述原因有关。

3.1.7 发酵时间

褐色酸奶在不同发酵时间下的感官评价得分如图7所示。

图7 不同发酵时间下褐色酸奶的感官评分

由图7可知，发酵8h感官评分显著高于其他各个发酵时间 （P＜0.05）。该因素可作为 Box-Behnken响应面设计因素之一。相关研究均发现了与本文研究结果类似的现象，发酵温度是控制酸奶及相关花色产品品质的关键[16-21]。

3.1.8 冷却后熟时间

褐色酸奶在不同冷却时间下的感官评价得分如图8所示。

图8 不同冷却后熟时间下褐色酸奶的感官评分

由图8可知，未进行冷却后熟的褐色酸奶得分显著最低，但冷却后熟24h就足以获得良好口感，因此该参数可固定为24h。

根据上述分析，5项工艺参数可以根据单因素优化设计而决定：蔗糖与葡萄糖比例5:5，总糖添加量8%，稳定剂为HBA-2L-5型，褐变温度95℃，冷却后熟时间为24h，其余3项工艺参数褐变时间、发酵温度、发酵时间需要通过Box-Behnken响应面设计确定最佳的工艺参数组合。

3.2 工艺参数的Box-Behnken响应面优化设计

根据单因素试验结果及Box-Behnken中心组合设计原理，以褐变时间（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）3个因素，以感官评分为响应值进行响应面优化试验，试验设计方案及数据结果见表3。

表3 Box-Behnken响应面优化设计方案及数据结果

利用Design-Expert软件对表3试验数据进行多元回归方程拟合，其方差分析结果见表4，通过分析，建立以感官评分对褐变时间（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）的拟合方程如下：

Y=-28154.6+8.7A+1243.3B+116C-0.033AB-0.05AC+1.5BC-0.014A2-14.5B2-10.6C2

通过查询概率统计表，该模型F=31.88时，P＜0.0001，由表4可知实际模型F=183.43，这说明模型是极显著的。同样，通过查表可知，当失拟项F=1.28时，P=0.3946＞0.05，说明模型失拟项不显著。决定系数R2=0.9958，校正系数R2Adj=0.9903，表明感官评分的实测值与预测值之间具有较好的拟合度，表明该模型能够很好的对褐色酸奶感官评分值进行分析和预测。

通过方差分析，该模型中的一次项C与二次项A2、B2、C2对感官评分影响极显著，一次项A与交互项AC、BC对感官评分影响显著，一次项B与交互项AB对感官评分影响不显著，表明试验中褐变时间（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）都对搅拌型褐色酸奶的感官评分具有较大影响。由3个因素F值大小可以推断影响搅拌型褐色酸奶的各因素主次顺为：C＞A＞B，即发酵时间＞褐变时间＞发酵温度，详情见表4。

表4 Box-Behnken响应面模型方差分析表

为了考察各个交互项对褐色酸奶感官评分的影响，利用Design-Expert软件对回归方程进行运算，作出交互项的三维响应面图及等高线图如图9所示，能比较直观的解释各个变量和变量之间的对响应值的影响。通过Design-Expert对建立的回归方程进行参数优化分析，可得到感官评分最高时最佳生产工艺条件，即褐变时间239.47min、发酵温度43℃、发酵时间7.9h，在此条件褐色酸奶的感官评分为82.73。

图9 交互作用对感官评分的响应面和等高线

利用Design-Expert软件进行回归模型预测褐色酸奶的最佳生产工艺方案为即褐变时间239.47min、发酵温度43℃、发酵时间7.9h。为了检验该回归模型预测的可靠性，同时考虑到实际生产操作，将最佳生产工艺方案更改为即褐变时间240min、发酵温度43℃、发酵时间8h，其他工艺条件为蔗糖与葡萄糖比例5:5，总糖添加量8%，稳定剂为HBA-2L-5型，褐变温度95℃，冷却后熟时间为24h。在该条件下重复6次试验，得到产品的平均感官评分为83.1，感官评分的相对误差为0.44%，与预测值基本一致，说明该模型拟合度较好，能够较好地预测实际情况。测定其理化指标，酸奶的酸度为72°T，蛋白质含量为 3.8g/100g，脂肪 2.4g/100g，各项指标均符合GB19302-2010要求。

5 结论

通过试验确定了褐色酸奶的基本生产工艺条件，通过单因素试验确定了蔗糖与葡萄糖比例5:5，总糖添加量8%，稳定剂为HBA-2L-5型，褐变温度95℃，冷却后熟时间为24h。再在单因素试验的基础上，通过响应面法建立了多元回归模型，确定了褐色酸奶的其余最佳发酵工艺条件褐变时间240min、发酵温度43℃、发酵时间8h。如此生产的褐色搅拌型酸奶颜色呈现黄褐色，有浓郁的焦糖味。在此条件下的验证试验中褐色酸奶的平均感官评分为83.1分与预测值基本一致，最终产品呈黄褐色，焦糖风味与酸奶特有的风味相结合，口感细腻浓稠。