γ干扰素释放试验在终末期肾病合并肺结核患者中的应用研究

吕培 何红彦 贺向红 郭丹 王永

1河北省胸科医院心肾内科,石家庄050041;2河北省胸科医院神经内科,石家庄050041;3河北省胸科医院呼吸内科,石家庄050041

目前,结核病在全球的发病率较高,严重威胁着人类的生命健康,其属于一种比较常见的传染病。根据相关研究,在全世界的60亿人中,约有20亿人感染了结核杆菌,并且每年新增800万～1 000万例结核病患者,严重地危害着人类健康和生命安全［1-2］。终末期肾病患者由于免疫功能低下,且存在营养不良、贫血等,是结核高发人群,结核病患病率高于普通人群7.5～25倍［3］,病死率亦高于普通人群,结核菌主要通过呼吸道传播使人患上肺结核,约占结核病的85%,所以终末期肾病患者合并肺结核逐渐受到重视,及时诊断并控制结核感染对终末期肾病患者提高生存率至关重要。

结核病的发病历程相对比较隐匿,而终末期肾病患者之所以感染这一类疾病,是因为在早期发病中很难观察到明确的临床症状、体征变化及影像学特征,且因为纯蛋白衍生物 (purified protein derivative,PPD)试验受机体免疫能力的影响,所以容易引起假阴性结果［4］,其准确性备受质疑。近几年,在免疫学检测技术的高速化发展下,γ干扰素释放试验(interferon-γrelease assay,IGRA)被广泛应用于早期结核病临床诊断中,其敏感度比较高,特异性也比较强,得到了国际上结核病防控领域的普遍认可［5-6］。本研究通过对肺结核患者、终末期肾病患者及终末期肾病合并肺结核患者进行试验研究,检测其血浆中γ干扰素 (interferon-γ,IFN-γ)的含量,并将PPD 试验与IGRA 试验分别应用于终末期肾病合并肺结核患者中,对比2种试验的阳性率,探讨IGRA 在终末期肾病合并肺结核患者诊断中的应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 自2015年1月至2016年3月在河北省胸科医院招募研究对象,获得所有受试者的知情同意。本研究符合《赫尔辛基宣言》的原则。

终末期肾病组40例,为有慢性肾脏病史且肾小球滤过率＜15 ml·min-1·1.73 m-2的患者,无结核病接触史及结核中毒症状临床表现,PPD 试验阴性。其中男22例,女18例,年龄范围为30～74岁,平均年龄52岁。

肺结核组40例,为肺结核初治患者,其抗结核的临床治疗周期低于4周。其中男19例,女21例,年龄范围为19～81岁,平均年龄50岁。在这些患者中包含痰抗酸杆菌涂片阳性患者或者痰抗酸杆菌培养阳性患者及痰抗酸杆菌涂片阴性或者培养阴性患者,但在临床上具有比较明显的肺结核特征、临床表现及影像学特征,且抗结核治疗有效,排除其他痰菌阴性的非结核性肺部疾病患者。入选者均无基础肾病, 肾小球滤过率约为125 ml·min-1·1.73 m-2,经过临床证实不存在明显急性病毒感染史。

终末期肾病合并肺结核组30例,有慢性肾脏病 史, 且 患 者 的 肾 小 球 滤 过 率 ＜15 ml·min-1·1.73 m-2,通过痰抗酸杆菌涂片、培养阳性等临床检验,或者经纤维支气管镜、组织病理学检查及肺活检,可以确定为抗酸杆菌阳性,或者诊断为菌阴肺结核,但抗结核治疗有效的新发肺部疾病患者。其中男21例,女9例,年龄范围为37～80岁,平均年龄57岁。

1.2 方法

1.2.1 IGRA 试验 采用英国牛津原装进口试剂,采用酶联免疫斑点技术进行IGRA 检测。对血样进行收集,通过离心操作获得外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),并充分洗涤后对细胞进行计数;PBMC、结核特异抗原一起放置在预包被抗体的相关反应孔内部,孵育过夜,温度控制在37 ℃,CO2含量为5%。将T淋巴细胞释放的细胞因子和预包被的抗体融合起来,然后洗板并引进二抗,进行1 h的孵育;经过洗板操作然后引进第五显色液,7 min后停止蒸馏水的反应,1个斑点代表1个效应T 淋巴细胞。按照产品说明书规定,当阴性对照孔斑点数为0～5个,且抗原A 或抗原B 孔斑点数—阴性对照孔斑点数≥6;阴性对照孔斑点数为6～10个,且抗原A 或抗原B孔斑点数≥2×阴性对照孔斑点数时,结果为阳性,否则为阴性。

1.2.2 PPD 试验 在采集IGRA 试验用血的同时,对终末期肾病合并肺结核组进行PPD 试验,通过皮内注射结核菌纯蛋白衍生物0.1 ml,48 h观察一次,72 h判读结果,对经过注射而引起局部红肿处进行观察,测量其硬结横径及纵径,取平均值作为硬结直径,＜5 mm 为阴性,5～9 mm 为弱阳性,10～19 mm 为阳性,≥20 mm 或者出现局部水泡、局部坏死及淋巴管炎,均诊断为强阳性。

1.3 统计学分析 采用SPSS 19软件进行统计学分析。对3 组IFN-γ含量采用Shapiro-Wilk 法进行正态性检验,对于不符合正态分布的数据以M(Q1,Q3)表示,3 组IFN-γ 含量的比较采用Wilcoxon秩和检验。终末期肾病合并肺结核组中IGRA与PPD 试验阳性率的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组IFN-γ 含 量 的 比 较 结 果 显 示,3 组IFN-γ 含量比较,差异有统计学意义 (Z=0.000,P＜0.01)。终末期肾病合并肺结核组和肺结核组患者血清中IFN-γ水平均大于终末期肾病组(P值均＜0.01)。见表1。

表1 3组患者γ干扰素含量的比较［M(Q 1,Q 3),SFCs/2.5×105 PBMC］

2.2 IGRA 试验与PPD 试验阳性率的比较 比较2种检测方法在终末期肾病合并肺结核组中的诊断性能,IGRA 的诊断阳性率为63.3% (19/30),明显高于PPD 的诊断阳性率 ［26.7% (8/30),χ2=0.004,P＜0.01］。

3 讨论

机体主要通过细胞免疫来对抗结核菌,然而,在终末期肾病患者中,机体内部缺乏充足的营养元素及维生素D,且患者的血磷较高,甲状旁腺功能亢进,T 细胞CD4+减少、CD8+减少等［7-10］都会引起免疫功能的低下,故容易合并各种感染及疾病,其中结核感染发生率较高,是结核病的高危人群。然而终末期肾病患者合并肺结核临床症状往往缺乏特异性,结核常见症状如疲劳、厌食、体质量减轻和发热等常被认为是尿毒症或透析的致热源反应或其他细菌感染,且影像表现多不典型,因此易延误诊治［11-12］。不仅如此,终末期肾病患者因免疫力低导致结核扩散发展迅速,病死率明显升高,据报道,终末期肾病合并结核的病死率在17%～75%不等［13］。因此,对终末期肾病患者的结核菌感染进行早期筛查,进而及时治疗和有效监测,对提高生存率、生活质量和结核病的防治具有重要意义。

目前对于我国结核病的临床诊断方法,比较常见的仍为PPD 试验,但因为PPD 抗原成分错综复杂,容易受到卡介苗接种的影响,且非结核分枝杆菌对其影响也比较大,所以特异度比较低。且在免疫功能低下的患者群体中,其敏感度低下,使得PPD 试验出现较高的假阴性率［14］。因此,限制了该方法在终末期肾病合并肺结核患者临床诊断中的应用。而IGRA 的主要原理为利用结核分枝杆菌的复合群、少数具备致病性的分枝杆菌基因内部的RD1区编码的早期分泌抗原靶6 000蛋白和培养滤液蛋白作为抗原,从而可以对受试者的PBMC 产生刺激作用,然后通过酶联免疫斑点法对分泌IFN-γ的细胞进行计数。且抗原靶6 000蛋白、培养滤液蛋白为结核菌所特有,在卡介苗与大多数分枝杆菌中都比较缺乏,所以有效减少了交叉免疫反应的出现,提高了检测特异性［15-16］。现阶段,对于IGRA 的应用,很多指南及建议中都有所体现,且被广泛应用于结核感染的临床诊断中。在本次课题研究中,选择终末期肾病患者、肺结核患者及终末期肾病合并肺结核患者为研究对象,对这些患者血浆中IFN-γ的含量进行对比分析,与此同时,在终末期肾病合并肺结核患者中进行PPD 及IGRA试验,比较2种试验的阳性率。根据研究结果,终末期肾病患者IFN-γ含量显著性低于肺结核患者及终末期肾病合并肺结核患者。而肺结核组、终末期肾病合并肺结核组IFN-γ含量差异无统计学意义。这充分说明,将IGRA 应用于终末期肾病合并肺结核患者中,对于疾病诊断具有重要的辅助价值。在终末期肾病合并肺结核患者中,IGRA 试验阳性率高于PPD 阳性率,这说明对于免疫功能低下的患者,出现PPD 假阴性率的情况比较多,而IGRA 可能是因为机体受到结核感染时,结核菌所特有的抗原靶6 000蛋白、培养滤液蛋白抗原刺激机体产生和释放的IFN-γ量可能主要受结核特异性抗原所影响,而与免疫反应的强度大小没有关系。由此可见,将IGRA 应用于终末期肾病合并肺结核患者中,免疫状态对其影响不大,具备比较强的检测敏感度,其检测敏感度明显超过PPD 试验。该方法对于终末期肾病合并肺结核患者,具备较高的临床辅助价值,这与相关文献报道内容［17-18］相符。

综上所述,本研究认为IGRA 在终末期肾病合并肺结核的诊断中具有较高的敏感度,有利于临床辅助诊断。但本研究病例资源有限,样本量过少,数据对比较单一,仍需大量样本研究,以期获得更准确、客观的结果。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突