阿卡斑病毒qRT-PCR检测方法的建立及应用

孟锦昕，李楠，何于雯，王静林

(云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南 昆明 650224)

阿卡斑病毒(Akabane virus，AKAV)属布尼亚病毒科(Bunyaviridae)正布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)辛波(Simbu)病毒血清群中的一个亚群，为单股负链分节段RNA病毒[1，2]。AKAV引起的赤羽病是造成牛、羊等动物流产、早产、死胎、畸形胎、木乃伊胎的一种虫媒传染病，对我国养牛业和养羊业危害较大，一旦暴发流行将会给畜牧业造成严重的经济损失[3]。

目前，已有很多AKAV诊断方法的研究报道，如病原学检查的电镜法[4]；抗体筛查的微量血清中和试验方法[5]、ELISA方法[6，7]、胶体金免疫层析试纸条[8]；核酸检测的RT-PCR方法[9]、套式RT-PCR方法[10]、SYBR Green I 实时荧光 PCR 方法[11]、环介导等温扩增(LAMP)检测方法[12]。这些方法为AKAV的检测搭建了重要平台，但随着分子生物学技术的发展，核酸检测方法必将成为病毒检测的一个重要发展方向，而实时荧光定量PCR(qRT-PCR)以其快速、敏感、高通量等优势已大量应用于疫病的检测中。已有报道以色列针对辛波血清群S片段建立了可以检测AKAV的real-time RT-PCR方法，但没有针对云南省流行的地方毒株的检测方法。本研究的目的是建立AKAV的 qRT-PCR 检测方法，为AKAV的检测提供新的技术手段。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及毒株信息

病毒RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司、One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)购自TaKaRa公司。AKAV毒株分离自师宗县库蠓，编号55，经全基因序列测定和病毒中和试验鉴定，毒株保存于本实验室-80 ℃液氮冰箱。蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)、辛德毕斯病毒(Sindbis virus，SINV)、Cat Que 病毒(Cat Que virus，CQV)、皮通病毒(Peaton virus，PEAV)由本实验室保存。

1.2 引物、探针的设计与合成

对云南省流行AKAV毒株的S片段序列进行分析，设计引物和探针，探针其5′端标记荧光报告基团，3′端标记非荧光淬灭基团。所设计的引物和探针既要保证特异性和高效性，又要避免与其他辛波血清群病毒的交叉反应。引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

AKAV-S-F：GCAGGGTATGTGGCATTTATC

AKAV-S-R：AGATCGACACTTGGTTGTGGC

AKAV-S-P：5′FAM-TTCCTCAACCAGAAGAAGGCCAAGAT-TAMRA3′

1.3 病毒标准品的制备

取编号为55的AKAV毒株在金黄地鼠肾细胞(Baby hamster kidney cell，BHK-21)上复壮，待80%细胞出现细胞病变(Cytopathic effect，CPE)时收毒，将细胞-80 ℃冻融2次，3 000 r/min离心20 min，上清液每管0.5 mL分装，-80 ℃保存备用。

取一管病毒液冰上化冻后在96孔板上作10-1～10-8稀释，每个稀释度作8孔，每孔病毒悬液为100 μL，加入BHK-21细胞悬液100 μL(1×106个细胞/mL)，每块板设8孔细胞对照。置37 ℃ 5% CO2培养箱培养，从72～168 h逐日观察记录CPE。用Karber方法计算细胞半数感染量(TCID50)。用细胞生长液稀释成100 TCID50/50 μL的病毒工作液作为病毒标准品。

1.4 反应条件的优化

提取病毒标准品的RNA，使用本试验设计的引物和探针进行扩增，确定最佳退火温度。扩增体系：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 10 μL，TaKaRa Ex Taq HS 0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.4 μL，Rox Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，Rnase-free ddH2O 0.4 μL，引物和探针各0.4 μL，加入RNA 2 μL，共20 μL。扩增程序：42 ℃反转录5 min，95 ℃预变性10 s，95 ℃变性5 s、退火(56 ℃、58 ℃、60 ℃、62 ℃)34 s，45个循环。

1.5 标准曲线的绘制

将病毒标准品做10 倍梯度稀释，稀释浓度为100～10-7，共8个稀释度，用病毒RNA提取试剂盒分别提取RNA，用优化的qRT-PCR方法进行检测，通过收集的荧光曲线判定Ct值，绘制标准曲线，获得回归方程。

1.6 灵敏度与特异性试验

灵敏度试验：提取稀释浓度为100～10-10的病毒标准品RNA，共11个稀释度，采用优化后的扩增程序进行扩增，确定AKAV qRT-PCR 检测方法可以检测到的病毒标准品最低稀释度，验证其灵敏度。

特异性试验：选择布尼亚病毒属辛波血清群的CQV和PEAV、甲病毒属的SINV、呼肠孤病毒科环状病毒属的BTV，提取这些病毒的RNA，同样的方法提取病毒标准品RNA，同时进行AKAV qRT-PCR检测，检验其特异性。

1.7 不同分离毒株及田间样本检测

应用建立的AKAV qRT-PCR方法检测2013年、2014年从师宗县采集的库蠓、黄牛血液、山羊血液中分离到的5株AKAV；检测2014年师宗县采集的黄牛血液样品280份和山羊血液样品140份。

2 结果

2.1 病毒标准品

编号55的AKAV样品的TCID50效价为10-4.25，将分装的病毒液做177.83倍稀释后，得到含量为100 TCID50/50 μL的病毒标准品。

2.2 退火温度的优化

将AKAV qRT-PCR退火温度分别设置为56 ℃、58 ℃、60 ℃、62 ℃，在60 ℃退火时，扩增曲线最好，扩增Ct值最低，因此，确定AKAV qRT-PCR检测方法最佳退火温度为60℃。

2.3 标准曲线的绘制

分别提取稀释浓度为100～10-7的标准对照病毒液RNA，共8个稀释度，编号1-8，进行AKAV qRT-PCR检测，建立标准曲线。以稀释度编号为x轴，以Ct 值为y轴进行回归曲线的绘制，得到AKAV qRT-PCR检测的标准曲线。相关系数(R2)为0.9976，回归方程为y=3.6488x+7.5179(图1)。说明所建立的AKAV qRT-PCR检测方法具有良好的线性关系。

图1 AKAV qRT-PCR的标准曲线

2.4 灵敏度与特异性

AKAV qRT-PCR方法能检测到10-8倍稀释的病毒标准品，表明该方法具有良好的检测灵敏度(图2)。以CQV、PEAV、SINV、BTV的病毒RNA为模板，和AKAV标准品RNA同时进行AKAV qRT-PCR检测，结果显示对CQV、PEAV、SINV、BTV的核酸检测结果均为阴性，表明该方法具有一定的特异性(图3)。

注：从左至右依次代表稀释浓度为100-10-8的病毒标准品曲线，1-45代表循环数。

注：1-45代表循环数。

2.5 分离毒株与田间样本的检测结果

对云南省师宗县不同来源分离到的5株AKAV毒株进行qRT-PCR 的检测结果显示，建立的AKAV qRT-PCR 检测方法对细胞分离毒株检测的Ct 值在11.40～13.49(表1)。通过对2014年师宗县采集的420份肝素抗凝血进行AKAV qRT-PCR检测，仅有5月20日的5号黄牛编号为09312的血样为AKAV核酸阳性，Ct值为30(图4)，且编号为09312的血样与病毒分离结果一致。

表1 AKAV分离毒株的信息及病毒核酸qRT-PCR 检测结果

注：P.阳性对照；N.阴性对照；1-45.循环数。

3 讨论

阿卡斑在我国被列为二类传染病，也是从国外进口牛、羊必检的七种疫病之一。我国阿卡斑流行病学调查和病毒分离证实，AKAV在我国广泛存在且流行严重。据报道，2013—2016年AKAV引起广西30%的竹鼠发病，死亡率高达100%[13]，2018年AKAV引起上海市某奶牛场20头母牛发生流产、早产、死胎[14]，越来越多的AKAV分离和流行病例报道让我们不能忽视AKAV。建立云南省流行AKAV毒株的快速检测技术，对云南省AKAV的疫病诊断及防控具有重要意义。

目前建立的AKAV核酸检测技术大多都要经核酸的提取与纯化、PCR 反应或套式PCR反应、电泳、酶切、测序等才能得到检测结果，人为操作步骤多，费时费力，易污染和产生误差。因此，本研究选择云南省流行AKAV毒株S片段设计引物和探针，建立了AKAV qRT-PCR检测方法。本方法通过对反应条件的优化，使扩增曲线达到最优；为保证试验更准确合理，本研究对所用云南省地方AKAV毒株进行毒价测定，制备病毒标准品，保证每次试验使用的病毒含量一致，让测定结果更准确合理，从而达到了在分子拷贝水平上的定量；通过梯度稀释病毒标准品，建立标准曲线，线性关系较好；试验结果显示，本研究建立的qRT-PCR 方法最低可检测到10-8倍稀释的病毒标准品，且同属病毒以及其他虫媒病毒核酸均无扩增信号产生，具有良好的灵敏度和特异性。对分离毒株和田间血液样品的检测结果显示，本方法不仅能检测病毒核酸含量高的AKAV分离毒株，也能检测病毒核酸含量较低的血液样本，本方法既是检测病毒早期感染的手段，也是病毒分离的指路灯。

综上，本实验室建立AKAV qRT-PCR方法是一种快速准确、灵敏度高、特异性好的高通量检测方法。此方法对云南省阿卡斑病的早期诊断、批量检测、毒株分离有着重要意义，为云南省口岸检疫提供了一种有效的检测手段。