云南西北部地区家畜无形体感染的分子流行病学调查

姚明国，江佳富，高子厚，贾 娜，汤 丽，何志海，张 青，张 云，王 帆，杜春红

无形体属 (Anaplasma spp.)为革兰染色阴性细胞内专性寄生菌。该菌主要侵染人与动物的血细胞，并以包涵体的形式在宿主细胞胞浆中繁殖。无形体属目前包括嗜吞噬细胞无形体(A.phagocytophilum)、绵羊无形体(A.ovis)、边缘无形体(A.mar ginale)、血小板无形体(A.pl atys)、牛无形体(A.bovis)、中央无形体(A.centr ale)和山羊无形体(A.capr a)7种[1-2]。已确认能感染人的有嗜吞噬细胞无形体、山羊无形体和绵羊无形体3种[3-5]。人无形体病主要临床症状有发热伴白细胞、血小板减少和多脏器功能损害，治疗不及时可导致死亡[6-7];而嗜吞噬细胞无形体感染的家畜可出现不规则发热、贫血、体重减轻甚至死亡。绵羊无形体、边缘无形体和中央无形体主要侵犯反刍动物的红细胞，受其感染的动物可出现发热、贫血、黄疸和体重减轻;牛无形体主要感染牛，引起牛无浆体病[8];血小板无形体主要引起犬血小板减少症[9]。云南西北部地区地处我国西南边陲，与缅甸、老挝和越南3国交界，由高黎贡山、怒山、云岭等高大山脉和怒江、澜沧江、金沙江等江河流域形成的世界著名的“三江并流”纵谷地景观组成。该地区大山交汇，垂直高差显著，立体气候非常明显，动植物种类异常丰富，复杂的地形地貌和气候条件孕育了媒介生物高度多样性从而形成虫媒传染病的高发区[10-11]。养殖业是云南省大部分山区发展经济的主要产业，且家畜养殖多以放牧为主。既往研究表明，该地区家畜存在嗜吞噬细胞无形体、牛无形体等多种无形体感染的情况，但缺乏系统性的调查研究[12-13]。为了解该地区家畜无形体感染的情况，本研究采用分子生物学方法，对该地区家畜感染情况进行调查，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 样本来源 在云南省西北部地区的15个县、市采集家畜血液1 791份，其中牛血555份，羊血630份，犬血556份，马血33份，驴血17份。采样区分布见图1。用一次性真空采血针和无菌EDTA抗凝管采集家畜静脉血，编号后冷藏保存，带回实验室进行检测。

图1 云南省家畜样本调查采样点分布图Fig.1 Distribution of domestic sampling area in Yunnan Province

1.2 试剂与设备 血液基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN Geno mic DNA Kit)、Drea mTaq Green PCR Master Mix(2×)(Ther mo Fisher Scientific)、DL2000 DNA Mar ker、凝胶成像仪(Syngene)、PCR扩增仪(SENSO，Lab Cycler Gradient Fuses型)、水平电泳槽(JY-SPFT型)。

1.3 检测方法

1.3.1 DNA提取 取200μL抗凝血液，按照血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA。

1.3.2 PCR基因扩增 采用半巢式PCR方法扩增无形体16S r RNA基因660 bp片段。引物为Ehout1(5′-TTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACG-3′)、3-17pan (5′-TAAGGTGGTAATCCAGC-3′)和 Eh-out2(5′-CACCTCTACACTAGGAATTCCGCTATC-3′)[14]。

反应条件:第一轮扩增(Eh-out1/3-17pan，1 500 bp):预变性95℃、3 min，变性95℃、30 s，退火55℃、40 s，延伸72 ℃、45 s，终延伸72℃、7 min。第二轮(Eh-out1/Eh-out2，660bp):预变性95℃、3 min，变性95℃、30 s，退火57℃、40 s，延伸72℃、45 s，终延伸72℃、1 min。均为35个循环。

1.3.3 序列测定与分析 扩增产物经凝胶电泳成像，将出现约660 bp条带的PCR产物送上海(生工)生物工程有限公司进行测序，利用Seq Man软件将所得序列进行拼接。登录美国国家生物技术信息中心(NCBI)站点，利用“Blast Sequence Similarity Searching”工具将测序结果与Gen Bank中注册基因序列进行同源性比对，进行无形体种的确定。应用MEGA6.06软件，邻接法N-J构建系统发育树。将调查数据与实验数据整理后，运用SPSS 19.0软件对其进行统计学分析。

2 结 果

2.1 PCR扩增结果 PCR扩增共检出阳性条带586份，经测序成功并序列比对为无形体的样本共503份，另外83份主要为测序失败28份、埃立克体36份、非特异扩增杂菌19份。部分样本电泳结果见图2。

图2 部分家畜样本的PCR扩增产物电泳图Fig.2 Results of PCR amplified products electrophoresis in some blood samples

2.2 不同地区不同家畜无形体检测结果 PCR扩增共检出阳性条带586份，经测序成功并序列比对为无形体的样本共503份，其中牛、羊和犬的阳性率分别为 41.08%(228/555)、38.10%(240/630)和6.29%(35/556)，马和驴中均未检出任何无形体(表1)。测定扩增阳性片段的DNA序列，将获得序列做同源性比对，发现其中73株序列(14.51%)属嗜吞噬细胞无形体，226株序列(44.93%)属绵羊无形体，137株序列(27.24%)属边缘无形体，48株序列(9.54%)属血小板无形体，16株序列(3.18%)属牛无形体，3株序列(0.60%)属山羊无形体。其中牛样本检出6种无形体，以边缘无形体为主(75/228);羊样本检出5种无形体，以绵羊无形体为主(216/240)，但未检测到山羊无形体;犬血仅检出嗜吞噬细胞无形体。经统计分析，不同家畜样本检出无形体基因的阳性率差异有统计学意义(P＜0.001)，阳性率最高的是牛、其次是羊，犬最低，马和驴未检测到。15个县市中有12个县市的家畜样本检出无形体基因，主要分布在德钦县、香格里拉县、盈江县、腾冲市等县市，德钦县、香格里拉县和腾冲市检出的无形体种类最为丰富(表1、表2)。以盈江县的牛的样本阳性率最高(95.65%)，牛以边缘无形体为主。

表1 云南西北部地区家畜血液样本的无形体PCR检测结果Tab.1 Sample infor mation and test result

表1 (续)

表2 不同地区家畜血液样本无形体PCR检测结果Tab.2 Result of Anaplasms in domestic in different area 单位:(头)

2.3 检出的无形体序列分析 将PCR扩增出16Sr RNA基因序列分别与Gen Bank中注册的核苷酸序列进行同源性比较，其分别与6种无形体16Sr RNA基因序列的同源性＞98%，以立氏立克次体(Rickettsia rickettsii，DQ150682.1)16Sr RNA基因序列为外群构建系统发育树(图3)。不同地区检出的嗜吞噬细胞无形体16Sr RNA基因序列的同源性在96.8%～100%，种间差异较大分为几个小分枝。在香格里拉绵羊和黄牛检出的基因序列(TCB-7、TC-B-188)与韩国人血分离到的嗜吞噬细胞无形体菌株16Sr RNA基因序列(MH482862.1)的同源性为99.77%，仅有2个碱基的差异。从香格里拉和德钦的牦牛或黄牛样本中检出3株山羊无形体基因序列的同源性＞98.8%，但却分别处相邻小分枝。其中DQ-B-15与中国浙江蜱检出的中国株16S r RNA基因序列(KR261020.1)的同源性为99%，与中国黑龙江省患者血液分离株16Sr RNA基因序列(K M206275)的同源性为98.25%。羊和黄牛样本中检出48株血小板无形体序列，其同源性为97.9%～100%，其中YJ-B-80与哥斯达黎加株(KY389143.1)、菲律宾株(JQ8947792.2)和中国株(KU586031.1)的16S r RNA基因序列100%同源。在牛、羊中检出16株牛无形体16Sr RNA基因序列的同源性为97.6%～99.8%，与湖北山羊株、韩国蜱株聚在同一分枝，HP-B-3与俄罗斯株(KC484563.1)16Sr RNA基因序列完全一致。检出的所有边缘无形体16S r RNA基因序列的同源性为98%～100%，与南非、菲律宾等地的羊和蜱株聚为一群。

系统发育进化分析表明，云南省西北部地区家畜样本中检测到的无形体分布在6个无形体种群中，包括嗜吞噬细胞无形体、绵羊无形体、边缘无形体、血小板无形体、牛无形体、山羊无形体。但TCB-6、YJ-B-76株不能与同源性较高的同种无形体聚在同一个分枝(图3)。

图3 基于无形体16Sr RNA基因660 bp片段构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on 660 bp fragment of 16Sr RNA gene

3 讨 论

本研究以云南省西北部地区的牛、羊、犬、马和驴为主要调查对象，应用分子生物学的方法，了解这些与人类密切接触的家畜感染无形体病的情况，为家畜无形体病的防治提供参考，为人感染无形体病的风险进行评估。调查共在15个县(市)采集1 791份血样，以当地家庭养殖的主要动物牛、羊、犬为主，共检出503头/只动物感染了6种无形体，牛、羊和犬的感染率分别为41.08%、37.97%、6.29%。在采集到羊血样本的11个县(市)，除盈江县外均存在自然感染，而盈江县可能因样本量太小(仅5份)有关，羊共感染了除山羊无形体外的5种无形体，以绵羊无形体为主。在6个县(市)采集了牛血样本，全部县市均存在自然感染无形体的情况，种类达6种;5个县(市)采集的犬血样本仅德钦县的犬存在感染嗜吞噬细胞无形体。其中盈江、华坪、云龙等县家畜检出无形体的阳性率较高，如盈江县的牛检出率高达96.56%，而香格里拉、腾冲和德钦等县市检出无形体的种类最多。尤其是对人致病的嗜吞噬细胞无形体和山羊无形体主要分布在滇西北的德钦、香格里拉、腾冲地区。通过16S r RNA基因序列分析，牛、羊、犬检出的嗜吞噬细胞无形体16S r RNA基因序列同源性为97.5%～100%，在香格里拉绵羊、黄牛和犬样本中检出的基因序列与从韩国人血分离到的菌株的16Sr RNA基因序列(MH482862.1)同源性高达99.77%。嗜吞噬细胞无形体可以感染人，引起人粒细胞无形体病(HGA)，硬蜱、血蜱、扇头蜱等多种蜱类可作为传播媒介，主要宿主为野生哺乳动物，包括美洲野牛、白尾鹿、狼、牛、羊、犬、马和兔等[14]。1994年美国报道了首例HGA病例，之后相继在北美洲、澳洲、欧洲、亚洲等地发现HGA，且感染人数和确诊病例呈逐年上升的趋势[15-16]。2006年我国报道首例实验室确诊HGA病例[14]，此后在山东、浙江、江苏、黑龙江、新疆等地先后检测到嗜吞噬细胞无形体核酸和/或抗体[17-19]。而山羊无形体是我国学者于2015年发现的人兽共患新病原体[5]。本次在德钦和香格里拉的牛样本中检出相应基因片段，两地牛血中检出的序列同源性为98.7%，其序列与中国黑龙江省患者血液分离的山羊无形体16S r RNA基因序列(K M206275)的同源性为98.25%，牛存在山羊无形体感染的情况值得关注。同时，本次调查在3份羊血中检出牛无形体、10份牛血中检出绵羊无形体的情况，一般认为牛无形体是感染牛、绵羊无形体感染羊，该结果需作进一步检测验证。

云南省西北部地区是我国生物多样性较高的地区之一，动植物物种极为丰富。尤其近年来随着天然林保护工程的实施，森林植被逐渐恢复，野生动物也随之增加。在经济相对落后的山区，发展养殖业成为山区群众脱贫的一种重要的方式。由于自然资源优良，牛、羊多进行放养，在滇西北高原还进行冬季和夏季牧场交替放牧的情况，家犬随主人和牧群转场，活动范围更广。而云南是我国蜱种最丰富的地区，据报道蜱种达46种之多[20]。野外放牧使得一些在野生动物体表寄生的蜱，寄生到家畜和家犬，同时进行疾病的传播，给人类健康和畜牧业发展带来危害。本次从30头牛、8头羊、35只犬样本中检出嗜吞噬细胞无形体、3头牛中检出山羊无形体，且基因序列相互同源性较高，与对人致病株的同源性也高，提示滇西北地区可能存在该疾病自然疫源地，犬感染传播给人类的风险更大，下一步需加强当地人群和蜱虫感染状况调查。同时，其它无形体感染，在不同程度上也会对养殖业带来危害，影响家畜繁殖、肉质产量和质量。因此，在发展养殖业的同时，需开展健康教育宣传工作，提高个人的防护意识，避免被蜱虫叮咬，加强家养动物的管理，如定期对动物圈舍、动物体表灭蜱等寄生虫，促进经济发展的同时保障人、畜健康。