鬼针草降血脂有效部位的筛选及其指纹图谱的测定

范琦琦 张雪 高梦迪

摘      要：研究了鬼针草不同提取部位对实验性高脂血症小鼠的影响，结合指纹图谱，优选出鬼针草降血脂最佳提取部位。选用SPF级昆明小鼠140只，随机选取20只作为基础对照组，饲以普通饲料，其余小鼠饲以高脂饲料进行造模，造模成功后，随机分为6组：模型对照组、洛伐他汀对照组、鬼针草石油醚萃取物组、鬼针草氯仿萃取物组、鬼针草乙酸乙酯萃取物组和鬼针草正丁醇萃取物组， 分别给予对应萃取部位药物。基础对照组和模型对照组每日给予等体积的生理盐水，连续30 d，检测血清TC、TG、HDL-C及LDL-C含量，确定降血脂最佳有效部位。结果与模型对照组比较，乙酸乙酯萃取物组和正丁醇萃取物组TC和LDL-C显著降低（P<0.01），HDL-C明显提高（P<0.05）。鬼针草乙酸乙酯部位萃取物和正丁醇部位萃取物对降低TC和LDL-C水平、升高HDL-C水平有较好的作用，有效改善血脂水平。

关  键  词：鬼针草;萃取物;高脂血症;TC;TG;HDL-C; LDL-C; HPLC

中图分类号：R284.2      文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2020）02-0581-04

Abstract： To study the effect of different extracts of Bidens on experimental hyperlipidemic mice， combined fingerprint， the best extracted parts of Bidens to reduce blood lipid were optimized. 140 SPF Kunming mice were chosen， and then 20 mice among them were randomly selected as the base control group， which were fed with ordinary feed， and other mice were fed with high-fat feed to build the model. After building the model successfully， they were randomly divided into six groups：model control group，lovastatin control group，bidens petroleum ether extract group，bidens chloroform extract group，bidens ethyl acetate extract group and bidens n-butanol extract group，given corresponding extract of Bidens.The base control group and the model control group were given the same volume of normal saline every day for 30 days，and the contents of serum TC，TG，HDL-C and LDL-C were detected， then the most effective part to reduce blood lipid was determined. Compared with model control group，TC and LDL-C were significantly decreased while HDL-C was significantly increased in bidens ethyl acetate extract group and bidens n-butanol extract group.The ethyl acetate extract and the n-butanol extract have good effect on lowering the levels of TC and LDL-C  and increasing the level of HDL-C，effectively improving blood lipid levels.

Key words： Bidens; Extracts; Hyperlipidemia; TC; TG; LDL-C; HDL-C; HPLC

近年來，高脂血症的发病率呈上升趋势。高脂血症是由于多种内外因素导致的人体内脂肪代谢或转运异常的代谢性疾病，是引起心脑血管疾病的首要缘由[1]。目前治疗高血脂的西药主要是他汀类药物，为有效控制高血脂症患者的血脂指标，降低心脑血管事件的发生率，研究和开发中草药作为降脂药物成为治疗高脂血症的一个研究方向。尤其根据活性组分导向原则将中药材制备成不同的提取部位，更有利于多靶点作用的实现，是中草药作为治疗高脂血症药物的优点。

中药鬼针草为鬼针草属植物（Bidens）的干燥全草，为菊科一年生草本植物，味苦，性平，归肝、肺、大肠经，具有清热解毒、散瘀消肿等功效[2]。鬼针草含有黄酮类、有机酸类、挥发油类、多炔类化合物等多种有效成分，具有抑菌抗炎、降血脂、降血压、保肝护肝、抗肿瘤和抗结石等药理作用[3]。目前，鬼针草的相关研究较为广泛，但对于鬼针草有效成分调节血脂的报道相对较少。本实验采用小鼠高脂血症模型，研究鬼针草不同部位萃取物对模型脂质代谢的影响，确定鬼针草的最佳降脂部位。

1  实验部分

1.1  实验动物

购于济南朋悦实验动物繁育有限公司的雄性SPF级昆明小鼠140只，体重（20±2）g。

1.2  高脂饲料

成分为普通饲料78.8%、猪油10%、蛋黄粉10%、胆固醇1%和胆盐0.2%。

1.3  药品及试剂盒

鬼针草采购于济南漱玉平民大药房;洛伐他汀胶囊，扬子江药业集团有限公司，批号：18072261;总胆固醇（T-CHO）测试盒，南京建成生物工程研究所，批号：20181128;甘油三酯（TG）测试盒，南京建成生物工程研究所，批号：20181127;低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）测试盒，南京建成生物工程研究所，批号：20181124;高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）测试盒，南京建成生物工程研究所，批号：20181127。

1.4  仪器及设备

细胞成像多功能检测系统（酶标仪）：Bio Tek Cytation5;高效液相色谱仪：Agilent高效液相色谱仪。

2  测定血脂指标与建立指纹图谱

2.1  鬼针草萃取物的制备

精密称取鬼针草药材1.8 kg，用12倍量80%乙醇回流提取2 h，提取2次。鬼针草提取液经减压回收乙醇后，分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和的正丁醇萃取四次，各有机层合并减压回收溶剂后分别得石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位，減压干燥后得干燥粉末。

2.2  建模

SPF小鼠140只，以普通饲料适应性喂养1周，随机分为基础对照组20只和模型组120只。基础对照组饲以普通饲料，模型组饲以高脂饲料，连续喂养3周后摘眼球取血，测得模型组血清TC、TG明显升高，HDL-C明显降低，则造模成功。

2.3  实验分组及给药

造模成功后，将模型组中的高脂血症小鼠随机分为模型对照组、洛伐他汀组、石油醚萃取物组、二氯甲烷萃取物组、乙酸乙酯萃取物组和正丁醇萃取物组，除洛伐他汀组每日给予药物洛伐他汀2 mg·kg-1外，其余组每日给予各萃取物5 g·kg-1（生药）。基础对照组和模型对照组每日给予等体积生理盐水，连续给药30 d。

2.4  指标测定

末次给药后，禁食不禁水12 h，称重并摘眼球取血后处死小鼠，采用氧化酶法测定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C，结果见表4。

2.5  统计学方法

统计学处理用 SPSS21.0 统计软件进行数据分析，采用T检验分析方法，认为P<0.05有统计学意义结果。

2.6  建立指纹图谱

2.6.1  指纹图谱供试溶液的制备

精密称取鬼针草正丁醇萃取部位和鬼针草的乙酸乙酯萃取部位萃取物各5 mg，分别在10.0 mL的容量瓶里用CH3OH溶液（分析纯）进行定容，配制成质量浓度为0.5 mg·mL-1的鬼针草萃取部位样品溶液。

2.6.2  色谱条件

色谱柱、流动相及流速、柱温、进样量及检测波长等相关条件如表1所示，流动相梯度洗脱条件见表2，初始浓度平衡5 min。

3  血脂指标与指纹图谱相关结果

3.1  血脂指标的变化

与基础对照组比较，模型组TC、TG显著升高（P<0.01或P<0.05）， HDL-C显著降低（P<0.05），说明造模成功。小鼠血脂指标见表3。

3.2  各部位萃取物对高脂血症小鼠血脂的影响

与基础对照组比较，模型对照组TC、TG、LDL-C显著升高（P<0.05或P<0.01），HDL-C显著降低（P<0.05）。与模型对照组比较，洛伐他汀组、乙酸乙酯萃取物组和正丁醇萃取物组TC和LDL-C显著降低（P<0.01）;乙酸乙酯萃取物组和正丁醇萃取物组HDL-C显著提高（P<0.05）;洛伐他汀组TG显著降低（P<0.05）。与洛伐他汀组比较，乙酸乙酯萃取物组和正丁醇萃取物组LDL-C含量相差显著（P<0.01）。石油醚萃取物组以及二氯甲烷萃取物组各项指标不明显，故鬼针草乙酸乙酯部位萃取物和正丁醇部位萃取物对降低TC和LDL-C水平，升高HDL-C水平有较好的作用，有效改善血脂水平。各组小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比较见表4。

3.3  鬼针草乙酸乙酯及正丁醇萃取部位的指纹图谱的测定

如图1所示，正丁醇萃取部位与乙酸乙酯萃取部位的各主要色谱峰保留时间相近，但强度差异较大。

鬼针草正丁醇部位前半段时间色谱峰较多且强，可能存在一些极性较大的化学物质，如黄酮多糖苷等。乙酸乙酯部位后半段时间色谱图显示出峰较多且峰强度大，可能相比于正丁醇部位所含物质极性小一些，如黄酮单糖苷和黄酮苷元等。以上分析表明这两种部位所含化学成分含量或者组成存在较大差异，可使用液质联用或者对照品等方法进行进一步分析所含化学成分。

4  有效降脂部位及色谱分析与讨论

4.1  有效降脂部位的分析

本实验采用小鼠高血脂症模型研究脂质代谢紊乱状况。实验表明，模型组小鼠血清TC、TG、LDL-C含量较正常组均明显升高，HDL-C含量明显降低，成功建立高脂血症实验模型。

各种脂蛋白在血浆中保持基本恒定的浓度，比例失调则发生脂质代谢失常或紊乱。LDL-C含量增加是导致冠心病的重要原因之一，LDL还与动脉壁上的多糖生成沉淀，纤维组织受到刺激增生，最终形成粥样斑块[5]。而TC与 LDL-C含量的升高多是伴发的，TC和LDL-C 含量愈高，患冠状动脉粥样硬化性心脏病的危险性越大[6]。HDL-C由肝脏和小肠合成，基本功能是将多余的胆固醇送到肝脏分解，抑制LDL-C的氧化，能够促使斑块缩小，保护内皮的完整性，因此对血管壁有一定的保护作用[7]。目前临床上治疗高脂血症以他汀类药物为主，他汀类药物降血脂疗效显著，但是存在着急性肝炎、晶状体混浊等不良反应[8]。

一方面，张媛媛[9]通过建立大鼠高血脂模型，发现鬼针草中的总黄酮物质可明显升高高密度脂蛋白（HDL）的含量，显著降低高血脂大鼠血清中的总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）的含量。另一方面，黄川锋等通过研究发现，高血脂大鼠血清中的NO含量明显高于正常组，过量的NO作为免疫介质能够发挥细胞毒作用，可导致心肌损伤等副作用，结果显示鬼针草乙酸乙酯萃取物可显著降低高血脂大鼠由NO过量引起的心肌损伤[10]。同时马瑜红等通过相关检测，发现鬼针草具有调节脂质代谢的药效作用[11]。为进一步研究高效的降血脂药用部位，本实验通过建立小鼠高血脂模型，对比分析鬼针草各萃取部位的降脂效果，结果得出，除洛伐他汀外，乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位降血脂效果较好，为鬼针草最佳降脂部位，可显著降低小鼠血清中TC和LDL-C含量，升高HDL-C含量，且降低LDL-C水平明显优于洛伐他汀。说明鬼针草有调节脂质代谢的功能，改善LDL-C氧化导致的动脉壁组织增生，减少粥样斑块的形成，保護血管，有效防治动脉粥样硬化和冠心病。鬼针草中化学物质主要为黄酮类等，杨秀东实验证明黄酮类含量在鬼针草乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物中高于其他萃取物，对鬼针草乙酸乙酯萃取部位使用液质联用，分析发现主要含有芹菜素及其苷类、木犀草素、木犀草苷等[12，13]。

经过以上总结分析，初步认为鬼针草乙酸乙酯和正丁醇萃取部位具有降血脂药效作用的可能主要为黄酮类成分。黄酮类化合物种类较多，对心脑血管等方面药用价值较大，因此鬼针草所含有的化学物质在降血脂方面有待深层次筛选分析，研究其发挥作用的主要化合物及结构。

4.2  色谱分析

流动相分别采用乙腈-甲酸（0.2%）、甲醇-甲酸（0.2%），乙腈-磷酸（0.2%）。分析图谱结果显示以乙腈-甲酸（0.2%）为佳。利用DAD检测器依次采集分析鬼针草样品溶液在254， 360， 380， 410 nm处的高效液相色谱图，结果表明以360 nm为佳，其所含有的色谱峰较多，同时鬼针草两种萃取部位的主要色谱峰分离度较好，峰强度较大。鬼针草乙酸乙酯和正丁醇部位具体成分还有待分析。

参考文献：

[1]刘晶， 崔建华. 高脂血症的中药治疗进展[J]. 天津药学， 2017， 29 （03）： 70-74.

[2]徐俊， 潘开瑞， 刘方洲.鬼针草总黄酮药效学研究进展[J].中医学报， 2017， 32（04）： 610-612.

[3]吴婷妮，余长柱，李荣，李俊.鬼针草的研究进展[J].安徽医药，2014，18（09）：1614-1616.

[4]石衍梅，李洁，蔚若川，曹海传，薛一涛.冠心病发病机制研究进展[J].中国冶金工业医学杂志，2016，33（02）：137-138.

[5]张志青，李艳玲，孙琪桓，赵志峰.TC和HDL-C与冠心病发病危险性的相关研究[J]. 白求恩军医学院学报，2012，10（05）：365-366.

[6]崔翔. 血清sVCAM-1、TNF-α、HDL-C水平变化与冠心病患者NF-κB的相关性研究[J]. 标记免疫分析与临床， 2018， 25（11）： 1611-1614.

[7]凡纪琮. 他汀类药物治疗高脂血症不良反应临床分析[J].名医， 2019 （05）： 244.

[8]张媛媛.鬼针草总黄酮对高脂血症大鼠的治疗作用及部分机制研究[D].合肥：安徽医科大学， 2012.

[9]黄川锋，马瑜红，周新，李玲，郝海鸥.鬼针草提取物对实验性高脂血症大鼠血脂和NO及NOS的影响[J].中国现代药物应用，2009，3（17）：14-16.

[10]马瑜红， 李玲， 欧阳静萍， 等.鬼针草不同提取物对非酒精性脂肪肝大鼠的实验研究[J]. 中国中医药咨讯， 2011， 3 （7） ： 5-6.

[11]李帅， 匡海学， 冈田嘉仁， 等.鬼针草有效成分的研究 （Ⅱ） [J].中草药， 2004， 35 （9） ：972-975.

[12]杨秀东，张嫔妹，王亚红，崔浩，周鸿立.鬼针草不同溶剂萃取物的总黄酮含量及抗氧化、酶抑制活性[J]. 江苏农业科学， 2018， 46（21）： 221-224.