茉莉酸甲酯和NaCl双重处理下刺槐叶片质膜H+-ATP酶变化特征研究

王子越，张粟斌，林可心，代靖娆，段泽浩，孟凡娟

(东北林业大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

四倍体刺槐tetraploidRobiniapseudoacacia又叫多倍体刺槐，是由二倍体的体细胞经诱导后形成，分为两种类型：速生乔木型和饲料型，其中前者主要表现为生长速度快，而后者属于灌木型，主要用于饲料生产，且无刺，叶片产量高，约为普通刺槐的2倍[1-2]。同时叶片干质量以及单株干质量也均为普通刺槐1.5倍以上，并且含有丰富的矿物质及维生素，而且微量元素较高(含有钙、磷等)，比家畜所需要的优质饲料高出较多倍[3]。

此外，四倍体刺槐具有较高的生态价值，主要表现为对低温、盐碱、干旱等恶劣的环境条件具有一定抗性，因此可以作为优良的绿化树种。四倍体刺槐的生长速度较快，可以作为盐碱地改良和土壤荒漠化治理的首选物种，由于高品质的饲料特性，可以用于牲畜的饲养，高的生产力可以缓解我国饲料业的压力，所以推广种植四倍体刺槐具有广阔的应用前景[4-5]。

茉莉酸类化合物(JAs)作为一种植物激素，主要包括：茉莉酸和茉莉酸甲酯(methyl jasmonates，MeJA)及其部分衍生物等[6-8]。许多研究已经证实：茉莉酸类物质在调控植物抗性方面起到重要作用，通常是以一种信号分子的形式参与植物的抗逆过程，同时具有与ABA相似的功能，可以促进植株衰老，调控气孔开关控制蒸腾，抑制Na+和Cl-两种离子的运输等[9]。但是有关茉莉酸甲酯如何提高四倍体刺槐耐盐性方面的研究还没有报道。

目前，针对植物耐盐机理的研究多利用拟南芥、玉米以及小麦等模式植物，然而对多倍体木本植物的研究较少。本研究则以耐盐的木本植物——四倍体刺槐为主要研究材料，观察茉莉酸甲酯与NaCl的综合作用效果，分析茉莉酸甲酯对两种刺槐在NaCl胁迫条件下的叶片质膜H+-ATP酶的影响差异，从而分析这种缓解作用是如何通过H+-ATP酶所作用的，以期为植物抗性机理研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

3月中旬，将二倍体和四倍体刺槐苗木移栽于塑料桶中(21 cm×21 cm)，培养基质为土和沙(2∶1)，在东北林业大学的塑料大棚内，采用常规的管理方式进行培养。在种植2个月后，选取生长状态一致的二倍体和四倍体刺槐植株分别进行NaCl和MeJA的处理，本试验共设计8组处理，包括两种刺槐植株，4种不同处理：对照(Hoagland培养液)、NaCl处理、MeJA处理、NaCl+MeJA处理。

每处理选择生长一致的10株植株，采用营养液配制500 mmol·L-1NaCl和100 μmol·L-1的MeJA溶液，采用喷洒处理，每次喷洒200 mL。每隔5 d处理1次，并在处理后第0、5、10、15 d对不同处理组进行取样，选取中部功能叶进行试验。

1.2 试验方法

H+-ATPase测定需要配置孵育溶液，主要包括：Pb(NO3)2(3 mmol)、MgSO4·7H2O(5 mmol)和ATP(2 mmol)。同时以不添加ATP二钠盐以及添加10 mol·L-1氟化钠的孵育液作为对照。然后选取功能叶片(0.5 cm×0.5 cm)，迅速投入戊二醛固定液，4 ℃固定2 h，然后利用二甲砷酸缓冲液清洗3次，再用Tris-Maleate缓冲液清洗，之后在孵育液中进行孵育。最后利用透射电子显微镜(JEM-100CXII)观察与拍照。

2 结果与分析

2.1 不同条件处理的H+-ATPase检测

对不同条件处理后叶片进行H+-ATPase定位分析，可以发现：未处理的刺槐叶片质膜上表现有H+-ATPase反应，即酶活性反应部位在细胞液泡膜上也存在(图1)。此现象表明刺槐叶片表现出了H+-ATPase活性，其中最活跃的是P型。在NaCl处理条件下P型被诱导，且在液泡膜上的V型活性也有表现但是不显著，而F型酶基本不表现活性。单独添加MeJA时H+-ATPase活性无显著变化，同时添加NaCl和MeJA时，可诱导H+-ATPase活性提高，但低于单独添加NaCl处理(图1)。

图1 不同处理二倍体刺槐叶片H+-ATPase细胞化学定位

2.2 二倍体和四倍体H+-ATPase的对比检测

经NaCl胁迫处理后H+-ATPase活性随时间变化而发生改变，对照二倍体和四倍体刺槐的叶片均有沉淀颗粒，集中在细胞边缘，表现为数量少且稀疏分布，同时细胞的膜和壁紧密结合。在NaCl盐处理后5天，黑色沉淀增多且体积变大，出现质壁分离现象。在NaCl处理10天后黑色的沉淀继续增多，尤其是四倍体叶片，沉淀颗粒出现黑色条带，同时在15天时沉淀继续增多，而相对于二倍体来说，并未明显增加而且减弱(图1和图2)。

图2 不同处理四倍体刺槐叶片H+-ATPase细胞化学定位

初步认为：NaCl处理可以导致二倍体刺槐细胞膜上的H+-ATPase活性提高，在第15天植株表现即将死亡后状态减弱，而四倍体植株的H+-ATPase活性一直呈现增加趋势。经过MeJA处理后，两种刺槐叶片的酶活性与对照没有明显差异。但MeJA处理后，淀粉粒的体积表现增大，数量也表现增加，同时MeJA和NaCl双重处理可以使二倍体的酶活性增加，并在处理15天时细胞膜破裂。四倍体在处理5天时酶活性增加，在后期与只进行NaCl盐处理没有表现出明显差异。

3 讨 论

植物H+-ATPase通常有3型：P型(位于细胞膜)、V型(位于液泡膜)和F型(位于线粒体及叶绿体)。其中，P型是一种重要致电泵，可以水解ATP从而产生能量，也可以实现H+的运输，并可以维持质膜两侧H+的浓度差(1～2个pH差)。从而可以通过完成离子和小分子代谢产物的跨膜运输，而这种运输主要依赖于能量累积以及电化学势梯度的推动[10]。在高盐状态下H+-ATPase对于离子区隔化也具有一定的作用。

叶片质膜的H+-ATPase活性变化与胁迫强度和时间有关。此结论与对枸杞的试验中发现的结果一致，即随胁迫物质的浓度升高，H+-ATPase活性表现为先上升后下降趋势[11]。同时在对胡杨进行研究时也获得了相同的结论，例如：胡杨在盐处理后H+-ATPase酶活性增加，然而盐敏感I-14杨酶活性降低[12]。因此，可以说明通过测定质膜H+-ATPase活性强弱可以检测植物的耐盐性高低。本试验显示四倍体的H+-ATPase酶活性较强，且细胞结构稳定，这可能是四倍体抗盐性较强的原因之一。因此可以通过H+-ATPase的活性观察来判断植物的耐盐性。

同时我们也发现：茉莉酸甲酯和NaCl的双重处理可以使二倍体的H+-ATPase酶活性逐渐增加，说明茉莉酸甲酯可以在一定程度上提高二倍体刺槐的耐盐性，而茉莉酸甲酯对于抗盐性较强的四倍体刺槐来说，作用并不明显，另一个方面也说明了四倍体刺槐较为耐盐，而茉莉酸甲酯在提高四倍体刺槐耐盐性方面的作用不够明显。