不同蜜源蜂蜜挥发性成分差异分析

魏泉增，臧蓓蕾，肖付刚

（1.许昌学院食品与生物工程学院，河南许昌461000；2.许昌学院河南省食品安全生物标识快检技术重点实验室，河南许昌461000）

蜂蜜中的挥发性成分不仅是蜂蜜品质的重要组成部分，也是蜂蜜种类差异性的重要体现。蜂蜜中包含了400多种不同的化学物质，95%以上是糖和水，其中包括大约38.5%的果糖、31%为葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和其他复杂的碳水化合物，以及不到5%的少量物质，包括蛋白、维生素（主要是 VB6、VB1、烟酸、核黄素、VB5）、矿物质（包括钙、铜、铁、镁、锰、磷、钾、钠和锌），色素，香味物质，游离氨基酸[1]。单萜类、倍半萜类、苯的衍生物、高级醇、酯类、脂肪酸、酮、萜类、醛类等挥发性物质与蜜源植物类别有关[2]。所以，蜂蜜中的挥发性成分可以用来作为蜂蜜来源的标记物[3]，用来鉴定蜂蜜的蜜源。

传统挥发性成分提取方法有同时蒸馏萃取[4-5]、溶剂萃取法[6-8]、超声辅助萃取法[9]、动态顶空分析[10]和固相微萃取法[11-12]。目前，国内外已经有一些对单花蜜挥发性成分的报道，涂世等[9]通过超声辅助萃取法对油菜单花蜜的挥发性成分进行分析。粟有志等[13]对采用顶空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）法与气质联用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）分析新疆4种单花蜜挥发性组分，确立了每种单花蜜的特征性组分。L.Castro-Va’zquez等[14]确定了西班牙柑橘蜂蜜的特征性成分，主要为萜类物质。这些提取方法中，同时蒸馏萃取有可能产生新物质，超声辅助萃取，提取物质种类较少，溶剂萃取只能提取与溶剂极性相似的物质。固相微萃取技术是在固相萃取基础上发展起来的一种用于富集挥发性化合物的新技术，无需溶剂，操作简便，已广泛应用于挥发性、半挥发性物质的分析[15]。

蜂蜜的挥发性成分主要来自于蜜源植物[16]，因此本研究选用了8种不同蜜源的蜂蜜作为研究对象。采取顶空固相微萃取的提取方法，GC-MS分析8种不同蜜源蜂蜜的挥发性成分，确定蜂蜜的潜在标记物，以期望通过挥发性成分来鉴定不同蜜源蜂蜜奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料、仪器

荆条蜜、荆花蜜、枣花蜜、野酸枣蜜、苕子蜜、椴树蜜、洋槐蜜、野山花蜜：卓宇蜂业采购部。

7890B-7000C型气相色谱质谱联用仪：美国Agilent公司；A1004N电子天平：上海菁海仪器有限公司；HH-1恒温水浴锅：常州智博瑞仪器有限公司；萃取手柄和萃取头：青岛贞正分析仪器有限公司。

C6～C10及C8～C40正构烷烃：百灵威科技有限公司；15 mL顶空瓶：安捷伦公司。

1.2 样品前处理

1 mL的蜂蜜置于15 mL顶空瓶中，65℃恒温水浴，平衡20 min，采用活性炭/聚二甲基硅氧烷（carboxen/polydimethylsiloxane，CAR/PDMS）涂料萃取头，65 ℃顶空吸附20 min，进样口250℃解吸附3 min，色谱分析。

1.3 色谱条件

色谱条件：1701色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气 He（99.999%）；恒流，柱流速为 1 mL/min；分流比为 10 ∶1；进样口温度为 250 ℃；压力：19.93 kPa；升温程序：温度50℃保持4 min，以3℃/min升至130℃，以8℃/min升至205℃，再以4℃/min升至250℃。

质谱条件：EI源，电子能量70 eV，四级杆温度150℃，离子源温度230℃，扫描模式Scan，扫描范围29 amu～700 amu。

1.4 成分鉴定

利用GC-MS的NIST14谱库对所得质谱图进行检索和分析，以质谱匹配度＞600作为物质鉴定标准，计算各化合物的保留指数（retention index，RI）并与文献中的RI相互比较，RI按公式（1）计算。用峰面积表示化合物的相对含量，化合物香味采用http：//flavornet.org数据库中的描述。

1.5 数据分析

试验数据经excel统计分析计算，试验数据采用PAST软件，采用Jaccard法对不同蜜源蜂蜜进行相似度聚类分析，采用模型Var-covar对不同蜜源蜂蜜进行主成分分析。

2 结果分析

2.1 不同蜜源蜂蜜挥发性成分分析

8种蜂蜜中的挥发性物质主要包括醇类、酯类、醛类、烯类、烷类、酚类等，不同种类挥发性物质的相对含量结果如图1所示。

由图1可知，枣花蜜中胺类物质含量最多。荆条蜜苯类物质、烯类物质和酯类物质含量最多；8种蜂蜜中醇类物质含量相当。枣花蜜中酚类物质含量最多。野山花蜜醛类物质含量最多。洋槐蜜、野酸枣蜜和枣花蜜中检测到酸类物质，且在洋槐蜜中的含量最高。野酸枣蜜酮类含量最多。荆花蜜和苕子蜜的挥发性物质种类含量偏低。

2.2 不同蜜源蜂蜜挥发性成分比较

图1 不同蜜源蜂蜜的挥发性成分Fig.1 Volatile components of honey from different honey sources

比较不同蜜源蜂蜜挥发性成分（醇类、酯类、醛类、烯类、酚类、烷类、酮类）的差异，分析结果见表1。

由表1可知，8种蜂蜜共检测出59种挥发性物质，椴树蜜中有30种，荆花蜜中有21种，荆条蜜中有16种，苕子蜜中有18种，洋槐蜜中有24种，野山花蜜中有27种，野酸枣蜜中有24种，枣花蜜中有32种。8种蜂蜜中共检出9种醇类物质，椴树蜜检出4种、荆花蜜检出4种、荆条蜜检出1种、苕子蜜检出2种、洋槐蜜检出3种、野山花蜜检出6种、野酸枣蜜检出4种、枣花蜜检出7种，结果表明：醇类物质在8种蜂蜜中差异明显。2，6-二甲基-3，7-辛二烯-2，6-二醇仅存在于枣花蜜中；苄醇只存在于洋槐蜜中，具有甜味和花香味。8种蜂蜜中含量最多的醇是3，7-二甲基-1，5，7-辛三烯-3-醇，其中枣花蜜中含量最多。芳香醇是脱氢芳香醇，是芳樟醇氧化物的前体物质。芳樟醇脱氢可能发生在蜂蜜的保存过程中。由于温度、pH值和酶活等条件，芳樟醇的含量有显著的差异。脱氢芳樟醇并没有检测到，但是检测到了2，6-二甲基-3，7-辛二烯-2，6-二醇，它也有可能是芳樟醇的前体物质[17-18]。

表1 HS-SPME提取蜂蜜挥发性物质Table 1 Extraction of volatile compounds from honey by HS-SPME

续表1 HS-SPME提取蜂蜜挥发性物质Contimue table 1 Extraction of volatile compounds from honey by HS-SPME

续表1 HS-SPME提取蜂蜜挥发性物质Contimue table 1 Extraction of volatile compounds from honey by HS-SPME

8种蜂蜜中共检出12种酯类物质，椴树蜜检出6种、荆花蜜检出3种、荆条蜜检出3种、苕子蜜检出3种、洋槐蜜检出4种、野山花蜜检出3种、野酸枣蜜检出4种、枣花蜜检出6种。结果表明：苯乙酸-2-苯基乙酯、1，3-亚苯基-双（3-苯基丙烯酸酯）只在洋槐蜜中出现；异丙醇，2-苯基乙酯在枣花蜜中未检出；生物碱乙酸甲酯是这8种蜂蜜共有的物质。

8种蜂蜜中共检测出12种醛类物质，椴树蜜检出7种、荆花蜜检出3种、荆条蜜检出3种、苕子蜜检出4种、洋槐蜜检出3种、野山花蜜检出8种、野酸枣蜜检出8种、枣花蜜检出5种，结果表明：醛类物质在8种蜂蜜中差异明显，5-甲基-2-呋喃甲醛只存在于野酸枣蜜中，壬醛是10种蜂蜜共有的成分，在枣花蜜中含量最多，椴树蜜中含量最少。

8种蜂蜜中共检测出7种烯类物质，椴树蜜检出3种、荆花蜜检出2种、荆条蜜检出3种、苕子蜜检出1种、洋槐蜜检出3种、野山花蜜检出2种、野酸枣蜜检出1种、枣花蜜检出3种，结果表明：烯类物质在8种蜂蜜中差异较小，D-柠檬烯仅存在于洋槐蜜中，10种蜂蜜中含量最多的烯是α-依兰油烯。

8种蜂蜜中共检测出4种酚类物质，椴树蜜检出3种、荆花蜜检出3种、荆条蜜检出2种、苕子蜜检出2种、洋槐蜜检出2种、野山花蜜检出2种、野酸枣蜜检出2种、枣花蜜检出2种，结果表明：酚类物质在4种蜂蜜中差异很小，4，4-（1-甲基亚乙基）双 [2，6-二甲基]-苯酚仅存在于椴树蜜中，3，5-双（1，1-二甲基乙基）苯酚仅存在于荆花蜜中，乙底酚（具有青草味和甜味）、地衣酚是8种蜂蜜的共有物质。

8种蜂蜜中共检测出4种烷类物质，椴树蜜检出4种、荆花蜜检出3种、荆条蜜检出3种、苕子蜜检出3种、洋槐蜜检出3种、野山花蜜检出3种、野酸枣蜜检出2种、枣花蜜检出3种，结果表明：烷类物质在4种蜂蜜中差异明显，十二甲基环己烷是8种蜂蜜共有的成分。

8种蜂蜜中共检测出4种酮类物质，椴树蜜检出1种、荆花蜜检出1种、荆条蜜未检出、苕子蜜未检出、洋槐蜜检出1种、野山花蜜未检出、野酸枣蜜检出1种、枣花蜜未检测出，结果表明：酮类物质在蜂蜜中含量较少，1-（1H-吡咯-2-基）乙酮仅存在于苕子蜜中，1-（2-氨基苯基）乙酮仅存在于野酸枣蜜中，8种蜂蜜中含量最多的酮类物质是3-甲氧基-7，11，18-三乙酰氧基-3，9-环氧孕甾-16-烯-20-酮。

2.3 聚类分析

聚类分析是将样品按照品质特性的相似成对逐渐聚合在一起，相似度最大的优先聚合在一起，最终按照类别的综合性质多个品种聚合，从而完成聚类分析的过程[19]。不同蜜源蜂蜜进行对比，如图2所示。

相似度最高是苕子蜜和野山花蜜，相似度为0.6，其次是野酸枣蜜和椴树蜜，相似度为0.55。结果表明：不同蜜源的蜂蜜挥发性成分明显不同。这为利用蜂蜜挥发性成分鉴定不同蜜源蜂蜜提供了依据。

2.4 主成分分析

主成分分析（principal components analysis，PCA）是一种降维或者把多个指标转化为少数几个综合指标的一种多元梳理统计方法[19]。将8种蜂蜜的数据进行主成分分析，不同蜜源蜂蜜挥发性成分PCA的分值图见图3。

图2 不同蜜源蜂蜜的聚类分析图Fig.2 Cluster analysis of honey from different sources

图3 PCA分值图Fig.3 Score plot for PCA

第一主成分的贡献率为62.4%，第二主成分的贡献率为18.6%，第三主成分的贡献率为9.13%。8种不同蜜源大致可以分为3类，荆条蜜为一类，荆花蜜、野酸枣蜜、苕子蜜、椴树蜜、洋槐蜜、野山花蜜为一类，枣花蜜为一类。

在PCA分值图中，不同蜜源蜂蜜点的距离相距越远，不同蜜源蜂蜜挥发性成分差异越明显。挥发性化合物组成不同是区分不同蜜源蜂蜜的基础，例如，5，5，8a-三甲基-3，5，6，7，8，8a-六氢-2h-铬烯，苄醇，十六烷酸乙酯，壬醛与生物碱乙酸甲酯等物质都可以作为区分不同蜜源的潜在物质。但是，某些化合物在不同的蜜源中并不是总出现，例如，苄醇只在洋槐蜜中出现，这对于从8种蜜源中鉴定出洋槐蜜十分便利。但是，不足之处是仅仅用这一个潜在标记物不能鉴定其他7种蜜源的蜂蜜。为了减少潜在标记物的数量，采用在8种蜜源蜂蜜中都检测到的壬醛与生物碱乙酸甲酯做为潜在标记物，利用壬醛与生物碱乙酸甲酯峰面积的比值做为区分不同蜜源蜂蜜的依据。计算结果表明，在椴树蜜中是2.90，在洋槐蜜中是3.53，在荆花蜜中是9.03，在荆条蜜中是16.76，在苕子蜜中是7.40，在野山花蜜中是8.47，在野酸枣中是8.63，在枣花蜜中是17.17，因此，采用壬醛与生物碱乙酸甲酯作为潜在特征物可以区分不同蜜源的蜂蜜。

3 结论

用HS-SPME法对8种不同蜜源的真蜂蜜的挥发性成进行GC-MS分析，结果表明，1 mL的蜂蜜置于15 mL顶空瓶中，采用CAR/PDMS涂料萃取头，GC-MS共鉴定出59种物质，包括12种酯类、12种醛类、4种烷类、9种醇类、7种烯类、4种酚类、3种酮类、3种萘类、2种苯类、2种酸类、1种胺类。聚类分析结果表明：不同蜜源蜂蜜挥发性成分组成的相似度不高。PCA分析结果表明：壬醛和生物碱乙酸甲酯可做为潜在特征物标记物，利用蜂面积比值可以区分不同蜜源蜂蜜。这为不同蜜源蜂蜜的综合利用和鉴定不同蜜源蜂蜜奠定了基础。