蛹虫草提取物泡腾片的制备工艺优化及其质量分析

樊桂灵，周翔宇，钱叶迁，李玉锋

（西华大学食品与生物工程学院，四川成都610039）

蛹虫草，也称为北虫草、北冬虫夏草，是一种药食兼用的大型虫生真菌，一般由活体虫蛹培养[1]。蛹虫草中含有虫草素、虫草多糖、虫草酸、蛋白质、维生素及微量元素等多种化学成分[2]，它和冬虫夏草的主要成分相差不多。其中虫草素又称蛹虫草菌素，是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗生素[3]。虫草素参与人体细胞代谢的多个过程，具有抗菌、抗白血病、抗肿瘤、抗衰老、免疫调节、抗缺血再灌注损伤及清除体内自由基等多方面药理作用[4]。虫草多糖是蛹虫草中含量较高的活性物质之一，它是一种良好的免疫促进物质，具有抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、增强免疫[5]、调节血糖[6]等功效。此外，虫草多糖也对补肺肾、益精气有明显功效，已应用于医药与保健食品的生产与研究[7]。蛹虫草对人的肺阴和肾阳都具有很好的滋补作用，在平衡、调节阴阳的效果上起着重要的作用，是上等的滋补佳品[8]，具有很好的研究开发前景。

泡腾片属于片剂中的一种特殊剂型，质量稳定，服用方便，起效迅速；它的口感也比较好，对于儿童、老人以及不喜欢服药的患者来说很适用，再加上泡腾片携带方便，所以极易受到广大患者的欢迎[9]。近年来泡腾片在食品和保健品领域被广泛研究利用，成果显著，如黑莓泡腾片[10]、维生素C泡腾片[11]等。

随着生活水平的提高，天然的保健食品更受人们的青睐。蛹虫草作为一种既可食用又可药用的保健型真菌，正逐渐走入市场，其食用方法大多数是泡茶、煮水、泡酒、炖肉等；在剂型上，目前的研究还停留在胶囊[12]、口服液[13]、汤剂等传统剂型，但是几乎没有将蛹虫草提取物制备成携带方便、起效迅速的泡腾片剂型的报道。而蛹虫草提取物泡腾片既能保留蛹虫草自身具备的抗氧化、免疫调节等功效，又能更好地利用泡腾片服用方便、生物利用度高等优点，同时可使食用菌的价值得到充分利用，具有广阔的发展前景[14]。因此本试验根据蛹虫草有效成分的理化性质，对蛹虫草活性成分进行提取，然后在前期单因素试验基础上利用正交试验优化原辅料配比，制备蛹虫草提取物泡腾片，以期为蛹虫草保健品开发提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蛹虫草：南江宏信生物科技有限公司；柠檬酸：武汉银飞化工有限公司；碳酸氢钠：湖南裕华化工有限公司；乳糖：郑州百思特食品添加剂有限公司；阿斯巴甜：安徽远征生物工程有限公司；聚乙二醇6000：郑州仁恒化工产品有限公司；葡萄糖：山东锐晟化工有限公司；虫草素：成都普菲德生物科技有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DZF-6021型真空干燥箱、BPG-9070A型精密鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；BDW1-FW-200型万能粉碎机：西化仪（北京）科技有限公司；AL104型分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；RE-52A型旋转蒸发器、RE-52AA型pH计：上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵：巩义市子华仪器有限责任公司；FD-1B-80型真空冷冻干燥机：南京覃思科技有限公司；TDP-1.5型单冲压片机：上海欧坝机电有限公司；YD-20KZ型片剂硬度仪：北京中惠天城科技有限公司；FT-2000SE型脆碎度检测仪：天津市天大天发科技有限公司；UV-2600紫外分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；Agilent 1200型高效液相色谱仪：美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 蛹虫草提取物的制备

将蛹虫草子实体在60℃真空干燥箱中放置24 h，然后取出，将样品粉碎，过60目筛，过筛后的蛹虫草粉末装在干燥后的玻璃容器中保存。称取适量的蛹虫草粉末于圆底烧瓶中，加入10倍量的蒸馏水，然后置于沸水浴中热回流提取3次，每次90 min，抽滤，合并滤液。将滤液旋转蒸发浓缩，浓缩液冷冻干燥后粉碎、过100目筛，制成蛹虫草提取物冻干粉。

1.3.2 泡腾片的常用辅料及制备方法

1.3.2.1 泡腾剂

泡腾剂由酸源和碱源组成。其中柠檬酸和酒石酸一般作为主要的酸源。考虑泡腾片的口感和外观，以及制备泡腾片的成本，然后通过预试验对比发现柠檬酸的口感更好，且酒石酸溶于水易产生浑浊，所以柠檬酸是作为酸源的首要选择；常用的碱源有碳酸钠和碳酸氢钠，而碳酸钠口感较差，故选择碳酸氢钠作为碱源。

1.3.2.2 填充剂

填充剂的种类也多种多样，生活中常见的就是淀粉、乳糖、糊精几种。考虑到口服泡腾片需要在水中完全溶解，而乳糖能溶于水且不易吸水，能够使制备的成品更加优良，所以选择乳糖作为填充剂。

1.3.2.3 黏合剂

加入黏合剂时，普遍选择水、乙醇或者聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）乙醇溶液作为黏合剂。由于泡腾片遇水则反应，而PVP乙醇溶液黏性过大，导致压片黏冲，故选用无水乙醇作为黏合剂。

1.3.2.4 润滑剂

润滑剂有水溶性润滑剂和水不溶性润滑剂两种。口服泡腾片需要考虑片剂在水中溶解完全，而且溶液不浑浊，所以一般选择水溶性好的作为润滑剂。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）6000 或聚乙二醇 4000、十二烷基硫酸钠、苯甲酸钠等几类润滑剂水溶性都良好，考虑它们的成本和润滑性，选用PEG6000更为适宜。

1.3.2.5 甜味剂

口服泡腾片中为了改善口感，一般都会添加甜味剂来调味。由于阿斯巴甜甜度大，能够有效地改善柠檬酸所造成的酸涩的口感，而且它不参与一般糖代谢，亦不会被微生物降解，适合糖尿病患者食用[15]，并且节约成本，非常适用，故可选择阿斯巴甜作为甜味剂。

1.3.2.6 制备工艺

泡腾片的制粒方法包括酸碱混合非水制粒、酸碱分别湿法制粒、干法制粒、直接压片和聚乙二醇包裹法等。经预试验发现，酸碱分别湿法制粒耗时长，工艺麻烦且压片效果不理想；干法制粒和直接压片制得的泡腾片容易裂片，且极易黏冲；聚乙二醇包裹法工艺制备耗费时间太长且工艺复杂；而酸碱混合非水制粒压片效果最好，片剂整洁美观，颗粒流动性好，崩解完全，黏冲现象少。因此选择酸碱混合非水制粒方式进行制粒。

1.3.3 蛹虫草提取物泡腾片的制备

按比例要求称取蛹虫草提取物冻干粉、乳糖、柠檬酸、碳酸氢钠、阿斯巴甜，充分混和均匀后加入无水乙醇，制得软材。通过24目筛进行制粒，在真空干燥箱中干燥3 h，干燥温度为50℃，取出后整粒，然后加入PEG6000混匀，压片，即得。泡腾片片重规格定为1.0 g。

1.3.4 蛹虫草提取物泡腾片配方的筛选

1.3.4.1 蛹虫草提取物添加量的选择

蛹虫草提取物是泡腾片的主要原料成分，它的添加量对蛹虫草泡腾片的口感、汤色、风味有明显的影响。分别称取 0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13 g蛹虫草提取物溶解于100 mL水中，该添加量相当于质量为1.0 g蛹虫草提取物泡腾片中蛹虫草提取物含量分别为8%、9%、10%、11%、12%、13%。以汤色、口感与香气（各5分）为评价标准[16]对蛹虫草提取物溶液进行感官评价，以此筛选蛹虫草提取物添加量。具体评分标准见表1。

表1 蛹虫草提取物添加量评分标准Table 1 Evaluation standard for the amount of Cordyceps militaris extract added

1.3.4.2 泡腾剂酸碱比例的选择

泡腾剂的酸碱配比影响泡腾效果。准确称取1.0 g碳酸氢钠（NaHCO3）分别和 0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3 g柠檬酸一起加到100 mL去离子水中，计算减少的质量，即为CO2产生量，再测量溶液的pH值，以CO2产生量和溶液的pH值为评价指标确定酸碱配比。

1.3.4.3 甜味剂阿斯巴甜添加量的选择

甜味剂阿斯巴甜能有效改善柠檬酸的酸涩口感，但添加量不适当反而会增加泡腾片的酸涩口感，因此应合理确定其添加量范围。分别准确称取一定量的甜味剂阿斯巴甜于杯中，各注入70 mL凉开水，然后进行品尝并作出感官评价[17]，以确定阿斯巴甜添加量。

1.3.5 正交试验优化蛹虫草提取物泡腾片制备工艺

张真真等[18]报道，泡腾剂的酸源和碱源的总量控制在40%～50%，崩解效果最好，故选择泡腾剂总质量为40%、45%、50%3个水平进行正交试验。固定润滑剂PEG6000的质量分数5%，以乳糖作填充剂，按照1.2.3方法制备蛹虫草提取物泡腾片，每组制备3批，分别以感官评价、崩解时限、硬度为考察指标设计L9（34）正交试验，对蛹虫草提取物添加量、泡腾剂酸碱比例、泡腾剂总质量、甜味剂阿斯巴甜添加量进行进一步的优化分析，从而确定出泡腾片最优配方。试验因素水平见表2。

表2 正交试验因素与水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

将不同配方的蛹虫草提取物泡腾片溶于水后，由10位接受过感官试验训练的感官评审员对泡腾片进行感官评价，以色泽、组织状态、风味、口感为评价指标，对泡腾片进行评分，10人评分结果取算数平均值，作为每项处理的得分。蛹虫草提取物泡腾片的感官评价标准见表3。

表3 蛹虫草提取物泡腾片感官评价标准Table 3 Sensory evaluation standard of Cordyceps militaris extract effervescent tablets

1.3.6 工艺验证

按1.3.5项下所得最佳工艺条件制备泡腾片3批，以崩解时限、pH值、硬度为指标进行工艺验证。

1.3.7 蛹虫草提取物泡腾片的质量分析

1.3.7.1 外观检查

片剂表面应光滑完整，其大小和色泽均匀。

1.3.7.2 重量差异检查

随机取样品20片，先称定总重量，再对单片进行称量。计算出样品平均重量，比较单片重量与平均重量。片剂重量在0.3 g及0.3 g以上的，重量差异限度为±5%，超出重量差异限度的不能大于2片，并不能有1片超出限度1倍[19]。

1.3.7.3 崩解时限测定

随机取样品6片，分别放进6个250 mL烧杯中，再加入200 mL的常温蒸馏水。烧杯中迅速产生大量气泡，气泡消失完全后，泡腾片应溶散彻底无残留。规定泡腾片必须在5 min内崩解完全[19]。记录下样品崩解的时间，然后计算出平均值。

1.3.7.4 pH值测定

随机取蛹虫草泡腾片6片，分别放进100 mL烧杯中，加入100 mL常温蒸馏水，等待泡腾片完全溶解。然后测量各烧杯中溶液pH值。

1.3.7.5 硬度考察

取样品片剂5片，用片剂硬度仪检测泡腾片硬度。一般的片剂要求在50 N以上就能合格。

1.3.7.6 发泡量检查

由于CO2容易挥发且溶于水，量取的体积不准确。因此泡腾片发泡量的检查采用质量损失法，随机取样品10片，用研钵磨成细粉，精密称取适量片剂粉末（1 g左右），放进含水烧杯中，含水烧杯已经精密称定质量，等待气泡消失完全，再精密称量整个烧杯的质量。平行测量6组，分别计算单位质量CO2的体积，并取平均值[20]。

1.3.7.7 泡腾片中虫草多糖的含量测定

采用苯酚-硫酸法测定虫草多糖含量[21]。

1.3.7.8 泡腾片中虫草素的含量测定

采用高效液相色谱法测定虫草素含量[22]。

1.3.8 统计分析方法

使用SPSS24.0数据分析软件对结果进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 蛹虫草提取物泡腾片配方筛选结果

2.1.1 蛹虫草提取物添加量的选择

考察不同蛹虫草提取物添加量对泡腾片感官的影响，试验结果见表4。

表4 蛹虫草提取物添加量对泡腾片感官品质的影响Table 4 Effect of addition amount of Cordyceps militaris extract on sensory quality of effervescent tablets

由表4可知，感官品质评分随着蛹虫草提取物添加量的增加而呈现抛物线形的变化趋势。当添加量为11%时，感官评价分值最高，而当添加量继续增加，感官品质反而下降。这是因为蛹虫草本身含有鱼腥味和涩味，当蛹虫草提取物添加过多时会导致口感不好，且颜色变深，而添加量过少则没有蛹虫草特征味道。因此，选择蛹虫草提取物添加量为10%、11%、12%这3个水平进行后续正交优化试验。

2.1.2 泡腾剂酸碱比例的选择

泡腾剂比例对产气量和溶液pH值的影响见表5。

表5 泡腾剂配比对产气量和溶液pH值的影响Table 5 Effect of formula on gas-producing amount of effervescent agents and solution pH value

续表5 泡腾剂配比对产气量和溶液pH值的影响Continue table 5 Effect of formula on gas-producing amount of effervescent agents and solution pH value

结果表明，当碳酸氢钠与柠檬酸的质量比为1∶1.2时，产气量比较丰富。随着柠檬酸比例的增大，溶液pH值会越来越大。但是当pH值过大时，泡腾片溶液容易发涩，pH值太小，也对口感不利。综合考虑，选取泡腾崩解剂的酸碱比在 1.1∶1～1.3 ∶1（g/g）范围内进行后续正交优化试验。

2.1.3 甜味剂阿斯巴甜的选择

甜味剂阿斯巴甜的选择见表6。

表6 阿斯巴甜添加量对泡腾片甜味的影响Table 6 Effect of addition amount of aspartame on sweet degree

泡腾片的口感通常会受到甜味剂添加量的影响，因为甜味过浓或过淡都会使品尝者感到不舒服，因此本研究中添加的阿斯巴甜量设定为0.25%～0.35%，选取添加量为0.25%、0.30%、0.35%这3个水平进行后续的正交优化试验。

2.2 蛹虫草提取物泡腾片配方优化正交试验

泡腾片正交优化试验结果如表7所示。

表7 泡腾片配方优化正交试验结果Table 7 Results of orthogonal tests for the formula optimization of effervescent tablets

续表7 泡腾片配方优化正交试验结果Continue table 7 Results of orthogonal tests for the formula optimization of effervescent tablets

由表7可知，所考查的3个因素中各因素对感官评分的影响顺序是A＞D＞B＞C，蛹虫草提取物添加量对感官评分影响最大，水平优劣次序为A2＞A1＞A3，其次是甜味剂阿斯巴甜添加量，其水平优劣次序为D1＞D3＞D2；对崩解时限的影响顺序为 C＞B＞A＞D，泡腾剂总质量对崩解时限影响最大，其次为泡腾剂酸碱比例，水平优劣次序分别为 C3＞C2＞C1，B3＞B2＞B1；对硬度的影响顺序为C＞B＞A＞D，泡腾剂总质量对硬度影响最大，其次为泡腾剂酸碱比例，水平优劣次序分别为C3＞C2＞C1，B3＞B2＞B1，综合考虑多因素作用，最终确定最佳配比为A2B3C3D1，即蛹虫草提取物质量分数为11%，泡腾剂总质量分数50%，柠檬酸和碳酸氢钠的酸碱比例为1.3∶1（质量比），甜味剂阿斯巴甜质量分数0.25%。

2.3 工艺验证试验结果

按所得最佳工艺条件制备蛹虫草提取物泡腾片3批，进行工艺验证，结果见表8。

表8 工艺验证试验结果Table 8 Validation of the optimized formulation

结果表明，正交试验确定的最佳工艺较稳定，符合2015年版中国药典的规定。

2.4 蛹虫草提取物泡腾片的质量分析

按照正交试验得出的最优配方制备的蛹虫草提取物泡腾片，外观光滑完整，大小和色泽均匀，冲泡后溶液澄清透明，味道酸甜可口，并伴有蛹虫草特有香味。平均片重（0.994±0.01）g，相对标准偏差为1.01%，重量差异限度均小于5%；崩解效果较好，均在5 min内崩解；样品的硬度都达到了一般片剂的要求，均在50 N以上，各指标均符合2015年版中国药典的规定。所得溶液均呈弱酸性，1 g泡腾片粉末平均产生CO2体积（23.95±0.60）mL（相对标准偏差=2.50%）。按1.3.7.7、1.3.7.8项下方法求出，蛹虫草提取物泡腾片中虫草多糖的含量为（10.01±0.08）mg/g（相对标准偏差=0.80%），虫草素的含量为（0.65±0.01）mg/g（相对标准偏差=1.54%）。

3 结论

本试验旨在研究蛹虫草提取物泡腾片的制备工艺，可为其他食用菌的开发提供参考，具有较好的市场发展前景。本研究确定的泡腾片制备工艺操作方便、简单，黏冲少，出片顺利。

采取酸碱混合非水制粒的方法制备泡腾片，由于酸与碱完全接触，容易吸潮而导致泡腾片鼓泡、变形而失去泡腾效果，所以制好的泡腾片剂应该保存在干燥密闭的条件下。

蛹虫草中含有大量的营养物质，且具有抗氧化、免疫调节、降低血糖等功效，在药用和保健中起着非常重要的作用。医学上和市场上对于蛹虫草的研究和开发，为当代医学提供了更多的研究方向和药用价值。在本研究中，既保证了泡腾片性能，还保留了蛹虫草的特有风味，提升了蛹虫草的综合开发利用水平，为开发蛹虫草新剂型奠定基础。

本研究并未对制得的泡腾片进行生理活性评价，因此在以后的工作中，还应该进行泡腾片的活性评价研究，继续深入在体内药代动力学方面的研究探讨，以考察本试验所制得的泡腾片在药效和生物利用度方面的作用情况。