成年克隆猪肺脏差异蛋白的鉴定与功能分析

张树山，戴建军，吴彩凤，孙玲伟，韩雪峻，姜红菊，张德福∗

(1 上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海市农业遗传育种重点实验室动物遗传工程研究室，上海201106；2 上海种猪工程技术研究中心，上海201302)

张树山，戴建军，吴彩凤，等.成年克隆猪肺脏差异蛋白的鉴定与功能分析[J].上海农业学报，2020，36(4)：65-70

体细胞核移植(即克隆，Somatic cell nuclear transfer，SCNT)技术在猪上获得成功以来，尤其是与转基因技术结合后，在猪新品种培育和人类医学等多个领域产生了深远影响，并成为生命科学领域的重要研究热点之一[1-3]。 然而，一些成活克隆猪常伴有表型异常和不同程度的器官发育缺陷，一定程度上制约了猪体细胞克隆技术研究的进一步发展和应用[4-5]，故迫切需要阐明核移植操作对克隆猪发育的影响机制。从相关研究现状来看，探索该机制目前主要有分子水平和蛋白质组学水平研究两种途径。 在分子水平上，许多研究者从DNA 甲基化和乙酰化等表观遗传学角度在牛和猪上做了较多的研究工作，认为克隆动物常伴有不同程度的发育缺陷，其原因主要是核移植克隆中供体细胞表观遗传修饰重编程的稳定性较差[6-7]。 在蛋白质水平上，前人分别对克隆牛和猪的胎盘[8-10]、死亡克隆猪脐带的上皮细胞[5]、成年克隆猪的胰腺蛋白[4，11]及克隆猪的心脏蛋白进行了大量研究，为准确阐明克隆动物的器官发育异常的形成机制提供了新的线索。 目前，关于克隆猪肺脏蛋白的相关研究尚未见报道。 据此，本研究拟利用现已成熟的双向电泳-质谱体系的比较蛋白质组学技术，以本实验室前期获得的成年克隆猪和正常繁殖猪为研究对象，对二者的肺脏差异表达蛋白进行鉴定与功能分析，以期为揭示SCNT 操作对成活克隆猪的影响机制提供新的线索和理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

丙烯酰胺、甲叉-双丙烯酰胺、甘氨酸、TRIS 等购自美国Sigma 公司，乙醇、乙酸和甲醛等为国产分析纯。 Protein assay reagent 试剂盒、pH 3—10 干胶条购自美国伯乐公司(Bio-Rad)。 β-Actin 和GAPDH 抗体购自美国Proteintech 公司。

主要仪器有Dounce's 匀浆器(美国Kimble 公司)；U2800 紫外分光光度计(日本Hitachi 公司)；双向电泳凝胶系统(美国Bio-Rad 公司)；PDQuest 8.0 图像分析软件(美国Bio-Rad 公司)；UMAX 扫描仪(中国台湾世成科技股份有限公司)；4800 串联飞行时间质谱仪(4800 Plus MALDI TOF∕TOF，美国SCIEX 公司)；Trans-Blot Turbo 转印仪(美国Bio-Rad 公司)。

1.2 实验动物及样品采集与保存

肺脏组织蛋白样品分别采集自3 头成年体细胞克隆猪(7 月龄巴马小型猪，雄性)和3 头同品种、同性别、年龄相近的正常繁殖猪(对照)。 肺肌样品经生理盐水冲洗干净后切成小块置于冻存管，运回实验室移入液氮( -196 ℃)中冷冻保存。 蛋白样品提取、分离和Western blot 验证在上海市农业科学院畜牧兽医研究所胚胎工程实验室完成，双向电泳和质谱鉴定委托上海中科新生命公司完成。

1.3 解剖观察

样品采集过程中，分别对克隆猪与对照猪肺脏组织进行观察、解剖分析。

1.4 蛋白质样品的制备

蛋白提取：取大约300 mg 解冻肺脏组织样，加入PBS 清洗，切碎成1 mm3小块移至Dounce's 匀浆器中，加入DIGE 裂解液(DIGE 裂解液和酶抑制剂体积比50∶1)约1 mL，在冰上匀浆处理20 次。 将匀浆液经超声破碎处理后离心(12 000g，45 min)，取上清。

使用Protein assay reagent 试剂盒测定蛋白质浓度后置于-80 ℃保存备用。

1.5 双向电泳(2-DE)、凝胶染色和图像分析

双向电泳方法参照Park 等[11]并作调整。 含量为100 μg 的样品与水化上样缓冲液(尿素8 mol∕L，2%CHAPS，0.5% IPG 缓冲液，DTT 18 mmol∕L，并加0.001%溴酚蓝)充分混合。 使用pH 3—10 非线性胶条进行电泳。 电泳条件：30 V 12 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，8 000 V 8 h，500 V 4 h)；SDS-PAGE 电泳：为12.5%的胶(15 mA∕胶30 min，30 mA∕胶，至溴酚蓝离胶下沿0.5 cm)。

蛋白质双向电泳图谱采用Image Master 2D Platinum 软件进行图像分析，预测蛋白点分子量和等电点，并比较差异蛋白点。

1.6 胶内酶切和质谱检测

选择双向电泳胶上具有表达差异(2 倍以上)的蛋白点进行胶内酶切、MALDI-TOF-MS 质谱分析，每个差异蛋白点重复测定3 次。

1.7 Western blot 验证

预染Marker 和蛋白样品上样量分别为10 μL 和20 μg，12%聚丙烯酞胺凝胶、120 V 恒压电泳1.0 h，电泳缓冲液处理后的PVDF 膜在转膜仪上恒流转膜。 取出在封闭液(TBST 液加0.1% Tween-20 和5%脱脂奶)孵育1 h，加Ⅰ抗(抗兔β-actin 和内参GAPDH 抗体，均为1∶5 000)后4 ℃过夜。 利用TBST 液漂洗、加Ⅱ抗的TBST 液室温下孵育和TBST 液漂洗。 将光液均匀滴于膜上，暗室条件下反应、显影和定影，清水冲净晾干。 扫描并利用凝胶成像分析系统软件定量分析灰度值，根据内参蛋白GAPDH 的灰度值确定目标蛋白的相对表达量。

1.8 生物信息学分析

应用Mascot 搜索引擎进行蛋白检索和比对，并结合NCBInr 和Swissprot 数据库进行综合分析。

2 结果与分析

2.1 克隆猪肺脏差异蛋白的2-DE 凝胶表达谱

从1 000 多个差异蛋白中选择表达量差异在2 倍以上的共计26 个蛋白点进行MALDI-TOF-MS 质谱鉴定，双向电泳(图1)和质谱(表1)鉴定结果表明，克隆猪与非克隆猪的肺脏差异蛋白的等电点为4—10、相对分子质量为9—130 ku 。 22 个上调蛋白中除3#、6#、14#、15#、20#和21#蛋白外，其余均为酸性蛋白；4 个下调蛋白中24#和25#为碱性蛋白，其余2 个为酸性蛋白。 所有分离差异蛋白的pH 为4—10。 β-肌动蛋白的Western blot 验证结果表明，本试验中质谱鉴定结果是较可靠的(图2)。

表1 成年克隆猪肺脏差异表达蛋白情况Table 1 Differential expression of lung proteins in adult cloned pigs

2.2 克隆猪肺脏差异蛋白的生物信息学分析

利用生物信息学Gene Ontology(GO)方法对差异蛋白功能进行分析表明，与同品种、同龄和同性别正常繁殖猪相比，体细胞克隆猪肺脏的抗氧化相关、免疫能力等相关蛋白的表达水平上均存在较大差异(图1 和表1)。

26 个差异表达蛋白的主要分子功能分属8 类(图3 左)。 多聚胞嘧啶结合蛋白1(4#)和抑微管装配蛋白(13#)分别为翻译调节和分子传感器活性蛋白；催化活性蛋白包括核糖-5-磷酸异构酶(3#)、铁蛋白重链(5#)、超氧化物歧化酶2(14#)、N-乙酰神经氨酸合成酶(16#)、过氧化物酶5(19#)、L-乳酸脱氢酶A链(20#)、线粒体异柠檬酸脱氢酶α 亚基(21#)和过氧化物还原酶-2(26#)等；酶活性调节蛋白包括增殖细胞核抗原(2#)、胱抑素-A8(10#)、胱抑素B 蛋白(11#)、胱抑素-B(12#)和过氧化物还原酶-2(26#)等；抗氧化活性蛋白包括超氧化物歧化酶2(14#)、白蛋白(18#)、血红蛋白α 亚基(25#)和过氧化物还原酶-2(26#)等；转运活性蛋白包括血红蛋白β-亚基(7#)和血红蛋白α 亚基(25#)；结构分子活性蛋白有胱抑素-A8(10#)、胱抑素B 蛋白(11#)、胱抑素-B(12#)、线粒体异柠檬酸脱氢酶α 亚基(21#)和60S 核糖体蛋白L22(22#)等；除核糖-5-磷酸异构酶(3#)、血红蛋白β-亚基(7#)和免疫球蛋白γ-4 链C 区(6#)外，均具有连接蛋白功能。 差异蛋白的细胞组分分类表明(图3 右)，本试验中相关蛋白主要分布在细胞区域(19%)和细胞器(17%)中。

3 讨论

肺脏发育异常在成活克隆动物中较为常见，如世界首例克隆羊多莉早夭原因之一便是肺部感染，Hill等[13]、李世杰等[14]均报道了新生死亡克隆牛中有较高比例的肺脏发育异常。 本研究中解剖分析也发现，3 头克隆猪均存在不同程度的肺脏发育异常。 本研究利用双向电泳-质谱方法对克隆猪肺脏差异蛋白进行分离和鉴定，并借助生物信息学方法对部分重要的蛋白进行了逐一分析。

3.1 抗氧化相关蛋白

氧自由基(即活性氧，ROS)生成-消除的动态平衡的打破对细胞产生较大影响。 ROS 积聚会促进细胞生长增殖、激活细胞凋亡通路甚至导致细胞死亡[15]，故抗氧化活性蛋白一直是蛋白质组学研究中的热点之一。

线粒体中的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是一类抗氧化酶，能通过催化超氧阴离子自由基的歧化反应减轻超氧阴离子自由基(O2-)对机体的损害[16]。 其中的超氧化物歧化酶2(SOD2 或Mn-SOD，14#)被认为是氧化应激反应因子，是能清除ROS 的最重要抗氧化酶之一，且其对体内氧化应激较敏感，表达水平随着发生氧化应激即刻上调[17-18]。 早期研究发现，SOD2 的过表达可抑制癌细胞生长，在人肺癌肿瘤细胞上也得到了证实[17-18]。 本研究中，克隆猪肺组织中SOD2 过表达，可能是应对肺细胞内氧化应激的适应性改变。

哺乳动物细胞质中铁储存蛋白主要有铁蛋白重链(Ferritin heavy chain，FHC，5#)和铁蛋白轻链(Ferritin light chain)2 个亚基类型[19-20]。 两种铁储存蛋白中，只有FHC 具有亚铁氧化酶活性，能参与亚铁离子(Fe2+)转化为三价铁(Fe3+)，从而抑制了二价铁参与的芬顿反应，最终抑制细胞内羟自由基的产生。研究已证实，细胞内FHC 表达上调可能是机体应对氧化应激的急性期反应[21]。 本研究中，克隆猪的肺中FHC 过表达可能也是类似原因[21-22]。

过氧化物酶家族(Peroxiredoxins，PRDXs)属于抗氧化蛋白超家族，广泛存在于原核和真核生物中。PRDXs 包括Prx I、Prx II、Prx III、Prx IV、Prx V 和Prx VI 等6 个抗氧化蛋白，具有抑制胞内过氧化氢累积功能，不仅能降低细胞遭受氧化性损伤程度，也能通过调节过氧化氢水平实现对信号通路的调控[23-24]。 本研究中的Prdx5(19#)和Prdx2(26#)均是典型的含有2 个Cys 残基的过氧物酶。 PRDX2 具有能抑制过氧化氢诱导的细胞损伤和凋亡的功能[25]。 Prdx5 也是一个重要的抗氧化酶，在降低细胞内氧代谢生成的活性氧水平方面发挥重要作用。 在本研究中，低表达的Prdx2 和高表达的Prdx5 可能是细胞对较高水平过氧化氢的一种自发反应。

3.2 其他蛋白

本研究中，其他重要差异表达蛋白主要涉及翻译调节活性、分子转导活性、催化活性、酶调节剂活性、转运活性和结构分子活性等。

增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA，2#)定位在真核细胞核内，不仅是DNA 复制过程的必需因子之一，也参与了DNA 复制后修复[26-27]。 在医学疾病诊断上，PCNA 的表达水平被认为是细胞增殖状态的评价指数[28-29]。 本研究中，克隆猪肺蛋白中PCNA 表达水平显著高于正常繁殖猪，其原因可能是克隆猪肺细胞内存在较多的DNA 复制后修复。

核糖体蛋白质与核糖体RNA 共同组成了核糖体，是合成蛋白质的细胞器。 其中的60S 核糖体蛋白L22(60S ribosomal protein L22，RPL22，22#)也具有核糖体外功能，如DNA 复制、转录、 RNA 剪接和修饰，以及细胞生长增殖和凋亡调控等[30-31]。 早期研究认为，RPL22 也与一些遗传疾病相关[16]。 本研究推测RPL22 表达上调是猪肺器官正常生长发育的不利因素。

细胞骨架与细胞迁移、细胞分裂等细胞进程及基因表达调控相关，其基本成分之一为肌动蛋白(Actin)。 作为Actin 家族的一员，β-肌动蛋白(β-Actin，8#)是一个高度保守细胞骨架相关蛋白，在维持细胞结构、细胞内运动和细胞分裂等细胞生理活动方面发挥着重要的作用[32]。 然而，最新研究发现，一直被认为是高度保守的β-Actin 的表达水平也随着外界应激或疾病而发生变化。 也有研究认为，β-Actin 具有调控细胞结构的功能[33]。 本研究中，可能是肺组织发育异常导致的病理状态造成其中蛋白氧化损伤程度较高，使得克隆猪肺蛋白中β-Actin 发生过表达[34]。

综上，本研究在蛋白质水平上证实，体细胞克隆操作对成活克隆猪肺脏发育存在不可忽视的影响，体细胞克隆技术仍需进一步优化和完善。