滤纸干血片样品用于自愿咨询检测HIV抗体的研究

冯长华 郑扬云 付玲 魏芳芳

[摘要] 目的 研究在自愿咨詢检测HIV抗体工作中，用采集末梢血制成滤纸干血片替代采集静脉血的可行性。方法 采集200例自愿咨询受检者的手指末梢血及静脉血（抗凝全血和非抗凝血）。将手指末梢血和静脉抗凝全血分别制成滤纸干血片样品，非抗凝血则分离出血清，并在不同条件下保存。用ELISA法和免疫印迹法检测HIV抗体，将检测结果进行比较。 结果 各类滤纸干血片与静脉血清经ELISA法检测，定性结果一致。与血清的测量结果相比，直径6 mm的滤纸干血片OD值有显著性差异（P<0.05）。直径10 mm的滤纸干血片OD值无显著性差异（P>0.05），滤纸干血片样品用生理盐水和pH7.4的PBS洗脱均可，300 μL的生理盐水洗脱效果更好。滤纸干血片保存1周的结果稳定。用免疫印迹法检测，滤纸干血片与静脉血清判读结论一致。 结论 采集末梢血制成的滤纸干血片，以ELISA法检测HIV抗体，结果可靠、稳定，且操作简便，运输和保存无生物危害，可替代采集静脉血用于自愿咨询HIV抗体检测工作。

[关键词] 滤纸干血片;艾滋病病毒抗体;自愿咨询;酶联免疫吸附实验;免疫印迹法

[中图分类号] R512.91          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2020）17-0144-04

A study of the application of dried-blood spot specimens on filter paper to voluntary consultation on HIV antibody detection

FENG Changhua   ZHENG Yangyun   FU Ling   WEI Fangfang

Department of AIDS and STD Prevention and Control，Nanchang Center for Disease Control and Prevention，Research Base of State Key Laboratory of Infectious Disease Prevention and Control，Nanchang   330038，China

[Abstract] Objective To study the feasibility of using collected peripheral blood to make dried-blood spots（DBSs）on filter paper instead of collecting venous blood in voluntary consultation on HIV antibody detection. Methods The finger peripheral blood and venous blood （anticoagulant whole blood and non-anticoagulant blood） of 200 consultation and detection volunteers were collected. Finger peripheral blood and venous anticoagulant whole blood（WB） were respectively made into dried-blood spot specimens on filter paper，while serum was disassociated from non-anticoagulant blood，and they were both stored under different conditions. The HIV antibody was detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） and immunoblotting test（IBT）， and the detection results were compared. Results When all kinds of DBSs on filter paper and venous serum were detected by ELISA，the qualitative results were consistent. Compared with the detection results of serum，the OD values of DBSs on filter paper with a diameter of 6 mm were significantly different（P<0.05）. There was no significant difference in the OD values of DBSs on filter paper with a diameter of 10 mm（P>0.05）. The dried-blood spot specimens on filter paper could be eluted with normal saline and PBS with pH 7.4，and the elution effect of 300 μL normal saline was better. The results of one week storage of DBSs on filter paper were stable. When IBT was used for detection，the interpretation conclusions of DBSs on filter paper and venous serum were consistent. Conclusion When ELISA is used to detect the HIV antibody in DBSs on filter paper made by collecting peripheral blood，the results are reliable and stable，the operation is simple and convenient，and the transportation and storage cause no biological hazards. It can be applied to voluntary consultation on HIV antibody detection as a substitute for collecting venous blood.

[Key words] Dried-blood spots on filter paper; HIV antibody; Voluntary consultation; Enzyme- linked immunosorbent assay; Immunoblotting test

截至2018年9月30日，全国报告现存活艾滋病病毒（HIV）感染者/AIDS患者849 602例，报告死亡262 442例[1]。估计现存活感染人数为125万[2]。还有40余万人尚未被检测发现。而报告的感染者中，绝大多数是患病后通过临床就诊，进行常规检查时发现的，提示通过主动检测（如自愿咨询检测）途径发现的感染者数量少。究其原因，有受检者心存顾虑的因素。目前，HIV抗体检测的常规样品为静脉采集的血清/血浆，需在医疗机构由专业人员操作。而很多人对个人信息非常敏感，忌抛头露面，如要到医疗机构等公共场所去现场采样，可能需承担很大的精神压力，因而主动检测的意愿降低，进而影响艾滋病的发现与治疗。因此，需要建立一种便捷的样品采集方式（如居家采样），以促进主动检测。滤纸干血片是一种较理想的载体，将手指末梢血滴入滤纸，制成滤纸干血片（Dried blood spot，DBS）[3]，无传染性，可通过快递投送等方式送至实验室检测。本研究对南昌市疾病预防控制中心采集的滤纸干血片，在不同条件下保存和洗脱处理，与同期静脉血清的HIV抗体结果相比较，探索在自愿咨询检测工作中，用采集末梢血制成滤纸干血片替代采集静脉血的可行性，并研究影响滤纸干血片检测结果的各种因素，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年3～12月在南昌市疾病预防控制中心进行自愿咨询HIV抗体检测的受检者200例（其中含随访已确证为艾滋病感染者112例）。受检者中，男女比4：1，年龄17～79岁，平均（35.0±14.1）岁，40岁以下年龄占比80%。在自愿咨询检测人群中，按婚姻状况，未婚比例占73%;按学历，大专以上学历比例占61%。

1.2 方法

1.2.1 仪器和试剂  使用无痛采血针采集手指末梢血，使用真空采血管采集静脉血分别装入5 mL非抗凝管。滤纸是英国Whatman公司生产的3号定性滤性，已划出直径为10 mm的圆圈。ELISA试剂是北京金豪公司生产的HIV（1+2）型抗体试剂，批号：2017111007，有效期：20181111。酶标仪（DNM-9602G）和洗板机（DNX-96）为北京普朗新技术有限公司产品。免疫印迹法试剂为MP公司生产HIV（1+2）型抗体试剂，试剂批号为AE7045，有效期至20190501。全自动免疫印迹仪为瑞士Tecan公司产品。

1.2.2 样品采集和保存  采集每一位检测对象的手指末梢血和静脉血非抗凝血。手指末梢血直接滴在滤纸上的圆圈中央，让其浸透并填满整个圆圈。在室温下干燥4 h制成滤纸干血片，分别用密封袋密闭包装。静脉非抗凝血分离出血清。滤纸干血片与血清置于同等条件。每人份滤纸干血片及血清样品均分成6～9份，在室温和2℃～8℃环境下分别保存3 d和7 d，用于研究不同条件对滤纸干血片检测结果的影响。

1.3 观察指标

1.3.1 洗脱滤纸干血片  同一人份滤纸干血片分别用直径6 mm和10 mm的打孔器取样后，置入试管中，加入洗脱液。洗脱液分别为生理盐水和磷酸盐缓冲液（pH值为7.4的PBS）。洗脱期间置于2℃～8℃冷藏保存。

1.3.2 ELISA法檢测  检测项目为HIV抗体。按不同时间、不同温度下保存的滤纸片，用不同种类、不同量的洗脱液处理后，将洗液全部加入酶标板孔，其余程序按照试剂说明书操作。同等条件下保存的血清按照试剂说明书操作。使用酶标仪双波长（测量波长450 nm，参考波长620 nm）测量各孔OD值。

1.3.3 免疫印迹法检测  将部分ELISA法检测后的样品（同一人份的末梢血滤纸干血片和血清），用全自动免疫印迹仪进行免疫印迹实验。两者实验结果进行比较。

1.4 统计学分析

采用SPSS19.0统计学软件进行分析，以配对t检验对样品OD值进行统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同规格的滤纸干血片经不同洗脱液处理的结果与血清比较

121人份样品（每人份样品包括静脉血清、直径6 mm和10 mm的末梢血滤纸干血片），滤纸干血片分别用生理盐水和pH7.4的PBS洗脱，ELISA法检测结果分别与同期静脉血清结果进行比较。直径6 mm的滤纸干血片用两种洗脱液洗脱，结果与静脉血清相比均有显著性差异（P<0.05），直径10 mm的滤纸干血片无显著性差异（P>0.05）。见表1。

2.2 不同用量洗脱液处理后的滤纸干血片结果与静脉血清比较

56人份直径10 mm的末梢血滤纸干血片，分别用100 μL、200 μL、300 μL、400 μL的生理盐水洗脱，ELISA法检测结果分别与同期静脉血清结果相比较，均无显著性差异（P>0.05），用300 μL生理盐水洗脱的结果更接近血清。见表2。

2.3 不同洗脱时间的滤纸干血片结果与静脉血清比较

50人份直径10 mm的末梢血滤纸干血片，分别用300 μL的生理盐水洗脱24 h和48 h，ELISA法检测结果分别与同期静脉血清结果比较，均与血清结果无显著性差异（P>0.05），48 h洗脱效果更好。见表3。

2.4 不同保存条件的滤纸干血片结果与静脉血清比较

50人份直径10 mm的末梢血滤纸干血片，室温（15℃～30℃）和冷藏（2℃～8℃）条件下分别保存3 d和7 d，用300 μL生理盐水洗脱48 h，ELISA法检测结果分别与3 d内的血清结果进行比较，均与血清结果无显著性差异（P>0.05）。见表4。

2.5 最佳条件下定性结果的比较

用ELISA法分次检测共200人份样品（每人份均包括常规采集的静脉血清及常温保存3 d的末梢血滤纸干血片，其中末梢血滤纸干血片用300 μL生理盐水洗脱48 h）。两种类型样品定性结果均一致。检出HIV抗体呈有反应（阳性）144例，无反应（阴性）56例。

2.6 免疫印迹实验定性结果的比较

取经ELISA法检测的样品27人份（其中有反应22人份，无反应5人份。同一人份样品包括直径10 mm末梢血滤纸干血片和血清，滤纸干血片用生理盐水洗脱48 h），用免疫印迹法进一步检测，检出20人份为HIV-1抗体阳性，2人份为HIV抗体不确定，5人份为HIV抗体阴性。同一人份滤纸干血片和血清的定性检测结论相同，部分滤纸干血片样品与血清的条带判读略有差异，但主要条带（env条带和p24条带）符合率100%。

3 讨论

滤纸干血片样品与血清样品相比，稀释3～6倍，OD值有所下降，但不会影响结果[4-6]，其结果受血片大小、保存时间和环境、洗脱液类型、洗脱时间等因素影响[7]。本研究中滤纸干血片的最佳条件是直径10 mm，用生理盐水过夜洗脱。而6 mm的滤纸片测量OD值与血清相比存在显著性差异，主要原因是部分弱阳性样品OD值差异较大，但均不影响定性结果。建议检测无反应结果应充分考虑检测窗口期，并适时的进行复检。本实验中，用PBS和生理盐水洗脱均可达到较好的结果[4]，但生理盐水洗脱效果更好，与杨晓莉等[5]研究结果一致。

有研究结果显示，用免疫印迹法检测滤纸干血片的HIV抗体与血清判读结论相同[4，8]。但部分样品会有个别条带的缺失。因人们对艾滋病结果高度敏感，建议ELISA法检测有反应的样品，通知受检者尽量到防控机构接受专门的确证检测及咨询关怀服务。

滤纸干血片结果较为稳定，在密封的条件下，可在室温或37℃放置长达30 d，在4℃保存90 d，在-20℃可贮存90 d以上，结果较为稳定[9，10]。但储存条件潮湿、温度高、时间长会导致滤纸干血片的OD值下降[11，12]。本研究中，滤纸干血片在室温下保存时间最长为1周，充分考虑了从采样到送达实验室所需的时间，其结果与文献相符。

目前，国内开展HIV抗体咨询检测主要有两个途径：一是基于各级医疗卫生机构和实验室资源的检测，二是基于自我检测。前者需借助专业人员和专门设施现场采样，受检者需要直面隐私泄露、社会歧视等社会问题，易产生极大的心理压力而影响检测意愿[13，14]。后者可能会因专业知识的缺乏以及自购试剂的差异，导致对检测结果的误导，也不利于防治部门掌握疫情动态和及时对感染者进行关怀与治疗。如受检者自采送血，样品送至相关专业部门进行检测，则可两者兼顾。本研究中，采样同时以口头询问的方式对受检者进行调查。调查显示，82%的人更倾向于采集手指末梢血，18%的人两者均可。采集末梢血可用无痛采血针，操作简单，无技术和人员资质要求。可在居家、小诊所、偏远地区及进行流行病学调查的社会场所进行取样，不受环境条件的限制，亦可减少外出调查工作人员的配比。还可用于婴幼儿、吸毒等采集静脉血较为困难的人群。同时，本研究中上门进行自愿咨询的受检者绝大多数为40岁以下的中青年，提示40岁以上的人群尤其是老年人主动到医疗机构接受咨询检测服务的概率较小，滤纸干血片的居家采集为之提供了一种新的检测途径。

滤纸干血片经干燥后，即不再具有生物活性，大大减少了对环境和人员的生物危害。运输时不需冷链设备，不用三级包装设施[13，15]，经干燥的滤纸片亦可作为无污染样本直接运输[3]。故在自愿咨询检测HIV抗体工作中，受检者采样并将滤纸干血片干燥后，注意用密封袋封装好，可以采用快递方法寄送，方便快捷，也免去抛头露面的心理负担，可以促进更多的需求者主动检测，及时了解自身的感染状况，进一步促进行为方式的改变。单位和部门之间，亦可将需运送的静脉血（全血或血清）制作成滤纸干血片运送，无需专人专车，节约了工作资源。

综上所述，采集末梢血制作成的滤纸干血片的方式，可替代传统的采集静脉血用于ELISA法检测HIV抗体，促进了自愿咨询检测HIV抗体等工作的发展。基于良好的稳定性，其亦可应用于HIV核酸等检测。

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（收稿日期：2019-11-21）