夏枯草多糖对小鼠Graves病的改善作用及其机制▲

向 娟 王邦琼 王 怡 徐 伟

(重庆三峡中心医院内分泌科，重庆市 404100，电子邮箱：haifanuu33@163.com)

Graves病又称毒性弥漫性甲状腺肿，是由促甲状腺激素受体(thyroid-stimulating hormone receptor,TSHR)的抗体激活甲状腺而导致甲状腺功能亢进的一种自身免疫性疾病。我国约有超过1 500万例的甲亢患者，而Graves病患者数量约占全部甲亢病例的85%[1]。Graves病每年发病率为2/10万至3/10万，约有3%的30～60岁女性及0.5%的男性患此病[2]。Graves病患者会出现体重减轻、眼球突出、四肢肢端粗厚肥大、局部黏液性水肿、怕热出汗、心悸、心动过速、失眠、对周围事物敏感、焦虑等症状，如果长期没有得到合适有效的治疗，会引起消瘦和甲亢性心脏病[3]。

近年来，应用含TSHR-A亚单位的腺病毒免疫建立Graves病动物模型被广泛应用于Graves病的研究，以探讨其发病机制和有效的防治措施。夏枯草多糖具有良好的免疫增强活性[4]，故本研究通过观察夏枯草多糖对小鼠Graves模型的影响，并探讨其通过调控Ras/Raf/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)信号通路影响小鼠Graves病的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体级别BALB/c雌性小鼠160只，购于重庆市中药研究院实验动物研究所[许可证号：SCXK(渝)2020-0006]，6～8周龄，体重18～20 g，适应性喂养1周，自由摄食饮水，明暗周期为12 h/12 h。

1.2 实验试剂与药品 TSHR抗体(TSHR antibody,TRAb)检测试剂盒(货号：TRE/96/2A) 购自天津阿斯尔生物科技有限公司；四碘甲状腺原氨酸(tetraiodothyronine，T4)试剂盒(货号：XYTL-D-162；CAS号：51-48-9)购自上海熹垣生物科技有限公司；三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine,T3;批号：032519191001)、干扰素-γ(批号：032519193029)、白细胞介素(interleukin,IL)-6(批号：032519193004)、IL-17(批号：032519193024) 和转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1;批号：032519193001)检测试剂盒均购自上海晶抗生物科技有限公司；二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒(批号：120915132)购自碧云天生物有限公司；二抗(批号：140740)以及Raf一抗(批号：297412-1)、磷酸化Raf(phosphorylated-Raf,p-Raf)一抗(批号297412-4)、丝裂原活化蛋白激酶的激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MEK)1/2一抗(批号：AA1217B8088ZJ2)、磷酸化MEK(phosphorylated-MEK,p-MEK)1/2一抗(批号：263178)、ERK1/2一抗(批号：286514)、磷酸化ERK(phosphorylated-ERK,p-ERK)1/2一抗(批号：284174)均购自达瑞抗体技术有限公司。夏枯草多糖(厂家：贵阳新天药业股份有限公司，国药准字：z19990052，批号：20190618)；甲巯咪唑片(厂家：Merck KGaA公司，国药准字：J20171078，批号：112635)。

1.3 Graves小鼠模型的建立 参照文献[5]，通过注射Ad-TSHR289腺病毒(购自广州云舟生物科技有限公司)建立Graves小鼠模型，具体操作步骤如下：选取150只小鼠，分别于第1天、第28天于小鼠胫前肌注射含2×109Pfu 优化Ad-TSHR289腺病毒的磷酸缓冲盐溶液1 mL；第49天后抽取各小鼠尾静脉血检测血清T4和TRAb水平，以小鼠血清T4、TRAb水平分别达到100 ng/mL、3 U/mL以上作为造模成功判断标准。

1.4 动物分组及干预 选取小鼠血清T4含量≥100 ng/mL且TRAb含量≥3 U/mL的模型小鼠30只，按随机数字表法分为模型组、夏枯草多糖组、甲巯咪唑组，每组10只。另取10只正常小鼠作为正常对照组。夏枯草多糖组给予夏枯草多糖(200 mg/kg)灌胃，0.4 mL/次，甲巯咪唑组给予甲巯咪唑(生理盐水溶解，50 mg/kg)灌胃，0.4 mL/次，正常对照组和模型组每日予同体积生理盐水灌胃，均1次/d，药物干预5周后测定相关指标。

1.5 观察指标

1.5.1 一般情况：观察4组小鼠的一般状态、活动、行为及毛色。

1.5.2 血清T4、T3及TRAb水平：小鼠末次给药后，禁食不禁水1 d，摘眼球取血3 mL置于4 ℃冰箱保存过夜，36℃下4 000 r/min离心10 min，静置后分离出血清。按照相关试剂盒说明书进行操作，采用放射免疫分析法测定小鼠血清T4、T3水平，采用放射受体分析法测定TRAb水平。

1.5.3 血清干扰素γ、IL-6、IL-17和TGF-β1水平：将试剂盒平衡至室温(20℃～25℃)，取上述血清，按照试剂盒说明书进行操作，利用酶联免疫吸附法检测各组小鼠血清干扰素γ、IL-6、IL-1和TGF-β1表达水平。

1.5.4甲状腺组织形态学观察：摘眼球取血后，立即用颈椎脱臼法处死小鼠，摘取小鼠甲状腺组织，置于10%福尔马林中固定，常规切片，进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色，在显微镜下进行组织形态学观察。

1.5.5 甲状腺组织相关蛋白表达水平：取1 g小鼠甲状腺组织于研磨器中，于液氮下进行研磨捣碎，依次加入RIPA和PMSF裂解液裂解组织，提取总蛋白，使用二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒对提取的总蛋白进行定量，按比例加入4×蛋白上样缓冲液，95℃变性5 min，置于-20℃保存备用。配制十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶，上样蛋白样品后，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，设置浓缩胶电压为80 V，分离胶电压为100 V，电泳结束后将蛋白转印至聚偏二氟乙烯膜，转膜结束后用TBST 缓冲液洗膜3次，5 min/次，加入由2% BSA TBS配制的封闭液中，于室温摇床上孵育2 h进行封闭。 完成后使用PBS洗膜2次，5 min/次，然后加入Raf、MEK1/2、ERK1/2及p-Raf、p-MEK、p-ERK一抗工作液5℃条件下孵育过夜(1 ∶2 000稀释)，孵育完成使用PBS洗膜3次，5min/次，室温条件下孵育二抗2 h(1 ∶10 000稀释)，再次使用PBS洗膜3次(5 min/次)将新鲜配制的电化学发光液滴加到聚偏二氟乙烯膜表面，转移至成像分析系统(购自济南欧莱博科学仪器有限公司)暗箱中曝光，采集图像并分析。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参，以相对光密度值代表蛋白相对表达量，实验至少重复3次。

1.6 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较行LSD-t检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠的一般情况 正常对照组小鼠未见活动、行为及毛色的异常。Graves模型小鼠易动、烦躁和出现互相攻击的情况并有一定的脱毛现象发生，粪便较多且垫料较为潮湿。给药处理5周后，夏枯草多糖组和甲巯咪唑组小鼠互相攻击、烦躁、易动和脱毛的现象均有不同程度减轻，粪便减少，其中夏枯草多糖组效果最为明显。

2.2 4组小鼠血清T4、T3及TRAb的水平比较 模型组、夏枯草多糖组、甲巯咪唑组血清T4、T3及TRAb水平均高于正常对照组(均P<0.05)；模型组、甲巯咪唑组、夏枯草多糖组血清T4、T3及TRAb水平依次降低(均P<0.05)。见表1。

表1 4组小鼠血清T4、T3及TRAb水平比较(x±s)

2.3 4组小鼠血清干扰素γ、IL-6、IL-17 和TGF-β1 水平比较 模型组、夏枯草多糖组、甲巯咪唑组血清干扰素γ、IL-6、IL-17 和TGF-β1 水平均高于正常对照组(均P<0.05)；模型组、甲巯咪唑组、夏枯草多糖组血清干扰素γ、IL-6、IL-17 和TGF-β1水平均依次降低(均P<0.05)。见表2。

表2 4组小鼠血清干扰素γ、IL-6、IL-17 和TGF-β1 水平比较(x±s)

2.4 甲状腺组织HE染色 正常对照组小鼠可见甲状腺滤泡上皮细胞成扁平状，排列整齐，滤泡中充满均匀的胶质，滤泡间质无充血。模型组小鼠甲状腺滤泡增生，滤泡体积增大，不规则，上皮细胞也呈不规则状，滤泡间质有血管浸润，滤泡腔内胶质不均匀，有向内突出的结构。夏枯草多糖组和甲巯咪唑组小鼠的甲状腺组织结构明显恢复，滤泡增生减缓。见图1。

正常对照组 模型组 夏枯草多糖组 甲巯咪唑组

2.5 4组小鼠甲状腺组织中相关蛋白表达水平比较 4组小鼠甲状腺组织中Raf、MEK1/2蛋白相对表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。模型组、夏枯草多糖组、甲巯咪唑组p-Raf、p-MEK1/2及p-ERK1/2蛋白相对表达水平均高于正常对照组(均P<0.05)；模型组、甲巯咪唑组、夏枯草多糖组血清p-Raf、p-MEK及p-ERK蛋白相对表达水平均依次降低(均P<0.05)，见表3和图2。

正常对照组 模型组 夏枯草多糖组 甲巯咪唑组

3 讨 论

夏枯草为唇形科植物夏枯草的干燥果穗，是一种多年生草本植物，我国主要产于湖南、浙江、江苏等地。夏枯草主要成分为三萜类、甾醇类、黄酮类和糖类等，其中夏枯草多糖为夏枯草的主要功效成分之一，研究已证实其具有抗氧化、免疫调节、抗病毒、抗纤维化、抗癌和抗补体等生物活性[6-8]。Graves 病是一种以体液免疫(Th2)为主的自身免疫性疾病，通过TRAb和TSH调控细胞内的信号通路，诱导甲状腺细胞增殖，合成分泌激素[9]。目前针对Graves病的免疫研究多集中在CD4+T淋巴细胞及其分泌的细胞因子功能的免疫调节等方面，CD4+T淋巴细胞识别甲状腺自身抗原并与其受体相结合而被激活，从而产生各种黏附分子和细胞因子，并激活淋巴细胞和B细胞，产生自身抗体[10]。胸腺是CD4+T细胞分化发育的主要场所，与体液免疫、细胞免疫有着密切的关系，对于维护机体的免疫功能非常重要，而夏枯草多糖是一种良好的免疫调节剂[4]。故研究夏枯草多糖对Graves病的影响，将有助于阐释夏枯草改善甲状腺功能的相关机制。

本研究成功建立Graves病小鼠模型后，给予夏枯草多糖灌胃治疗，发现夏枯草多糖可以缓解Graves病小鼠易动、烦躁、互相攻击及脱毛等症状，减少粪尿的排泄，同时可恢复Graves病小鼠甲状腺结构，减缓增生，并且效果较甲巯咪唑更为明显。此外，甲状腺相关指标测定结果显示，夏枯草多糖组血清T4、T3及TRAb 水平低于模型组及甲巯咪唑组，但仍高于对照组(P<0.05)，提示夏枯草多糖抑制Graves病小鼠血清T4、T3及TRAb表达，减缓病情，且效果优于甲巯咪唑，但还无法恢复至正常水平。

TSH主要通过PKA/ERK1/2途径发挥大部分的生物学效应，其中ERK1/2受体发生磷酸化调控甲状腺激素的合成和分泌[11]。研究表明，ERK是MAPK家族的重要亚族之一，Ras/Raf/MEK/ERK为ERK信号通路经典的激活途径；ERK1/2是促进细胞增殖的重要细胞信号传导途径，抑制ERK通路对于改善甲状腺细胞过度增殖至关重要[12-14]。Ras/Raf/MEK/ERK通路中，活化的Ras激活Raf，然后使MEK的两个丝氨酸残基磷酸化,活化其唯一的底物ERK1/2。活化的ERK形成二聚体，转入细胞核，参与细胞的增殖、存活、分化和凋亡[15]。我们采用免疫印迹试验检测法测定Graves病小鼠甲状腺组织中Raf、MEK及ERK的表达量及其磷酸化水平发现，与正常小鼠比较，Graves病小鼠甲状腺组织中Raf、MEK1/2蛋白表达水平无明显的变化，但其p-Raf、p-MEK及p-ERK蛋白表达水平升高，而夏枯草多糖组p-Raf、p-MEK及p-ERK蛋白表达水平均低于模型组及甲巯咪唑组(P<0.05)，这提示夏枯草多糖或通过抑制Raf、MEK及ERK的磷酸化调控RAS/Raf/MAPK/ERK信号通路，从而影响Graves病小鼠甲状腺激素的合成和分泌，发挥缓解病情的作用。

李红林等[16]研究发现，细胞因子干扰素γ、IL-6、IL-17、TGF-β1与游离T3、游离T4及TSH相关联，协同参与机体的免疫应答，导致甲状腺功能改变，引起Graves的发生。本研究结果显示，Graves病小鼠血清中干扰素γ、IL-6、IL-17 及TGF-β1 水平均升高，而夏枯草多糖组血清细胞因子水平均低于模型组及甲巯咪唑组(P<0.05)，这提示夏枯草多糖可抑制Graves病小鼠血清中干扰素γ、IL-6、IL-17和TGF-β1的表达。

综上所述，夏枯草多糖可能通过抑制Raf、MEK1/2及ERK1/2的磷酸化调控RAS/Raf/MAPK/ERK信号通路，从而抑制下游基因干扰素γ、IL-6、IL-17和TGF-β1的表达，影响Graves病小鼠甲状腺激素的合成和分泌，减缓了Graves病症。