眼科疾病中细胞表型转化的研究进展

韩雪，冯卓蕾

(哈尔滨医科大学附属第一医院眼科，哈尔滨 150001)

细胞表型转化目前在眼科疾病中主要有上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和内皮-间充质转化(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)。EMT与EndMT相似，表现出三点特征：上皮/内皮标志物表达下调；出现间质细胞标志物表达；上皮/血管内皮细胞增殖，细胞间连接消失，细胞极性改变，细胞迁移性及侵袭性增强[1]。研究表明，这种间充质转化机制与胚胎发育、肿瘤转移、创伤修复及组织器官纤维化有关，其中，细胞表型转化作为组织纤维化的发病机制之一，在多种细胞因子作用下参与眼部多种疾病的形成[2]。在角膜组织结构中，角膜基质与角膜内皮细胞在受到损伤时，角膜基质细胞具备的干细胞活性及角膜内皮细胞的不可再生性决定了角膜内皮细胞通过转变细胞表型来完成组织修复过程[3]。在白内障及青光眼术后，由于相关细胞表型的转化引发相关并发症，术后病情恢复难度增加；而新生血管性眼部疾病往往导致严重的后果，包括新生血管性青光眼导致的顽固性高眼压、视网膜新生血管导致的玻璃体积血以及增殖性玻璃体视网膜病变等。细胞表型转化的发现丰富了眼科相关疾病发病机制的理论和内容，现就眼科疾病中细胞表型转化的研究进展予以综述。

1 角膜疾病中细胞表型转化的参与机制

1.1Fuchs角膜内皮营养不良(Fuchs′ endothelial corneal dystrophy，FECD) FECD是一种遗传性、进行性的角膜后部疾病，可导致双侧角膜内皮细胞逐渐丢失、角膜内皮细胞分泌后弹力层成分增多、角膜水肿，在晚期可导致大疱性角膜病变[4]。虽然FECD是由角膜内皮功能障碍所致的疾病，但最终角膜的结构层次均会受到影响[5]。FECD以内皮细胞计数减少、残余内皮细胞形状和大小改变以及角膜滴状变性为特征。虽然角膜内皮细胞常被认为处于生长停滞状态，内皮细胞通过迁移覆盖内皮层缺陷的区域完成角膜内皮损伤的修复，但有证据表明角膜后缘和角膜内皮存在干细胞标记，内皮损伤后表达增殖标志物[6]。

FECD发展晚期，Claudin 10的表达显著下调，Claudin家族在维持不同类型上皮细胞及内皮细胞间紧密连接中起重要作用[7]。因此可以推测角膜内皮细胞屏障及泵功能均有所损害。在调控方面，已有研究表明，Claudin具有调控细胞增殖和分化的功能，Claudin的表达和功能受多种转录因子、激素和细胞因子的控制[8]。同样，在多种细胞因子作用下，活性氧类的过量产生可导致DNA、蛋白质和脂质的损伤，并作为多种途径的信号分子，导致细胞损伤[9]。炎症因子及活性氧类均可加重EMT进程，EMT的发生导致细胞外基质(extracelluar matrix，ECM)积聚，而ECM的累积使后弹力层增厚，进而加重角膜滴状变性[10]。在早期FECD中，内皮细胞较正常细胞产生更多的高活性重组人胶原蛋白8和丰富且异常的粗面内质网；在晚期FECD中，细胞内外均可见粗面内质网、扩张线粒体及上皮标志物；这些发现表明，在FECD中内皮细胞通过转变细胞表型使其具有成纤维细胞和上皮细胞的特征[11]。FECD中某些内皮细胞的成纤维细胞特征可能提示其在成熟和分化过程中的表型改变(如EndMT)，在EndMT过程中，单个内皮细胞可能从内皮细胞层分离并迁移到内皮下间隙，分化为一系列间充质样细胞类型[12]。

1.2角膜创伤修复 由于角膜创伤和屈光手术的不断增多，角膜创伤愈合成为一个重要的临床问题。角膜不同层次细胞的创伤愈合程度不同。基质伤口的愈合是通过角膜基质细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的一系列转化，以及固有及循环免疫系统细胞的参与，角膜上皮基质损伤会引发复杂的基质反应，可导致肌成纤维细胞发育成熟，表达波形蛋白、平滑肌肌动蛋白和肌间线蛋白，继而引起角膜基质的重建，而角膜基质创伤愈合过程通常导致角膜瘢痕形成[13]。有研究表明，角膜及其周围组织的神经可以通过增加分泌神经生长因子调节多种细胞因子的分泌，从而间接参与角膜损伤的修复过程，角膜基质细胞向成纤维细胞及肌成纤维细胞的转化是导致角膜基质混浊或纤维化的关键因素[14-15]。肌成纤维细胞是一种适合于在穿透性损伤后恢复角膜完整性的细胞，因为肌成纤维细胞有收缩伤口、分泌ECM以及与周围基质产生黏附结构的能力。肌成纤维细胞前体纤维细胞在角膜上皮细胞损伤后立即从角膜缘血管进入基质，角膜上皮损伤后的12～24 h，周围和后基质中残留的活化基质细胞开始增殖和迁移，这些增殖的基质细胞产生角膜成纤维细胞，而这些细胞可以重新填充耗尽的基质，并产生未成熟和完全分化的肌成纤维细胞[12]。

创面愈合过程受可溶性细胞活性因子、ECM的内在化学性质以及角膜细胞微环境的生物物理属性的调节，而可溶性细胞活性因子包括生长因子、细胞因子、蛋白酶和神经肽[16]。在角膜上皮愈合中，肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)作为旁分泌生长因子可介导EMT[17]。基质损伤后，基质细胞分化为纺锤形成纤维细胞，通过增加肌动蛋白的表达获得迁移表型，产生牵引力，使基质细胞增殖并迁移至损伤区域，通过凋亡重新填充已耗尽的基质细胞区域[18]。基质细胞-纤维细胞-成纤维细胞的转化由转化生长因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)和血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)所诱发，HGF是一种能够与TGF-β1诱导器官纤维化所抗衡的因子，HGF激活Smad7信号通路以防止Smad2磷酸化导致TGF-β信号通路的抑制[19]。因此，外源性HGF是促进角膜基质创面愈合和患者预后的潜在治疗工具。

2 白内障、青光眼术后并发症与细胞表型转化的联系

2.1后发性白内障 晶状体具有简单但高度有序的结构，其特征是前面单层的立方晶状体上皮细胞覆盖着一团拉长和分化的纤维细胞，这些细胞均包裹在一层厚厚的基底膜(晶状体囊膜)内。白内障作为全球第一位致盲眼病，是一种晶状体混浊使其透明度降低的过程[20]。后发性白内障是由于晶状体上皮细胞残留并且在房水中细胞因子和生长因子的作用下，上皮细胞向成纤维细胞转化使后囊膜细胞增殖变厚的过程。白内障手术作为一种创伤性手术，植入的人工晶状体作为异物可引起炎症反应，使前房中充斥炎症反应因子以及晶状体上皮细胞向成纤维细胞转化进而向肌成纤维细胞转化(即发生EMT)，均可诱发后发性白内障的发生[21]。

白内障手术破坏了血房水屏障，使前房中生长因子、细胞因子的含量增加，进一步促使EMT的发生，加速后发性白内障的发展进程[22]。当人工晶状体与晶状体上皮细胞接触时，晶状体上皮细胞开始纤维化增殖，在手术创伤应激下，晶状体上皮细胞Lumican表达增加，Lumican的表达可调节晶状体上皮细胞EMT的发生[23]。在晶状体上皮细胞中，活化的TGF-β可增加间充质标志物(如纤维连接蛋白-1、平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原α2重组蛋白)的表达[24]。TGF-β还可降低EMT细胞中上皮标志物晶状体蛋白αβ、缝隙连接蛋白43等的表达[25]。表皮生长因子与肿瘤坏死因子具有的协同作用，不仅促进晶状体上皮细胞增殖，而且刺激成纤维细胞增殖[26]。房水中正常水平PDGF可维持晶状体上皮细胞的正常功能，而PDGF水平一旦超出正常范围，则会引起晶状体上皮细胞异常改变，并促使其向成纤维细胞转化[27]。

2.2青光眼术后滤过泡瘢痕化 青光眼作为一种终身性疾病，可对视神经造成不可逆的损伤，在病情进展过程中，对于药物不能较好控制病情的患者可选择手术治疗。青光眼滤过手术是目前治疗青光眼的首选手术方法。术后滤过泡瘢痕大量形成是青光眼手术治疗失败的主要原因。伤口愈合的过度反应所导致的组织纤维化可能损害滤过性气泡的形成，并减少房水流出，从而逆转最初眼压降低的趋势[28]。由于手术可引起组织创伤，创伤区炎症和细胞因子的聚集使成纤维细胞移行至创伤区并增殖，上皮细胞在炎症环境中发生表型变化，导致增殖和迁移增加，组织重塑并分泌大量ECM，导致术区组织异常修复形成瘢痕，且结膜下滤过泡空间被纤维组织填充，进一步导致滤过手术失败[29]。细胞因子的积聚则会改变细胞增殖基因的表达以及细胞骨架和基质蛋白的基因表达，从而导致纤维化[30]。

在炎症早期，PDGF、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、TGF-β等加速了多形核细胞和巨噬细胞在术后区域的积聚[31]。在分裂素(如PDGF)诱导的原代和侵袭性成纤维细胞伤口愈合的增殖阶段，TGF-β介导由上皮/内皮细胞分化而来的成纤维细胞向具有高度收缩性的肌成纤维细胞转化，而肌成纤维细胞是伤口愈合的核心[32]。在组织损伤后，肌成纤维细胞有几个潜在来源，上皮细胞和内皮细胞均可通过脱分化转变为肌成纤维细胞参与组织修复[30]。

3 新生血管性眼部疾病中细胞表型转化的参与过程

3.1增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR) 慢性高血糖是糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)发生的关键因素，是导致主要组织器官损伤的重要原因[33]。当DR进展为PDR时标志着新生血管的形成，视网膜新生血管的发生、发展与细胞的激活、增殖和分化调控失常有关[34]。新生血管形成是PDR的病理基础，是DR严重的微血管并发症。随着糖尿病患者数量的急剧增多，PDR已经成为成人失明的重要原因[35]。在DR中，视网膜血管内皮细胞是血管新生的关键。在糖尿病状态下，视网膜组织缺氧、诱发血管内皮细胞激活、ECM降解、血管内皮细胞增殖和迁移，进一步导致不成熟的血管管腔结构和血管外膜的形成，最终形成不完善的新生血管[36]。目前研究发现，血管内皮细胞在糖尿病状态下发生表型的变化，即EndMT[37]。Cao等[38]研究证实，高糖作用下，人视网膜血管内皮细胞内皮标志物表达下调，出现间质标志物表达，细胞增殖，同时迁移能力增强，发生EndMT。

在高糖诱导下的视网膜血管内皮细胞中微RNA(microRNA，miRNA/miR)-29a和miR-29b的表达显著降低，miR-29a和miR-29b可负调控Notch 2的表达，而Notch 2的过表达又逆转了miR-29a/b对EndMT的抑制作用[39]。心肌纤维化研究显示，Notch信号通路可能启动EndMT[40]。因此，基于控制miR-29a/b表达的治疗可能是未来治疗PDR的一个方向。

在血管重构过程中，特别是在肿瘤血管系统以及与血管通透性增加和内皮功能障碍相关的疾病中，血管内皮细胞中的血管生成素(angiopoietin，Ang)-2水平升高，除Ang-2/Ang-1比值增加外，在败血症的研究中还报道了血管生成素受体Tie2水平降低[41]。这种变化可能使内皮细胞连接中的Ang-1/Tie2信号向Ang-2信号转移，从而减少Tie2磷酸化，使内皮细胞启动炎症细胞因子信号，血管通透性和结构遭到破坏；在这些条件下，Ang-2阻断抗体显示出有益的血管稳定作用，表明Ang-2在导致血管结构受损的过程中发挥了关键作用[42]。当内皮细胞进行胞外分泌时，Ang-2与Tie2结合，从而竞争性地抑制Ang-1，并与VEGF协同促进血管生长的改变；当Ang-1和Ang-2与VEGF协同作用促进血管生成时，Ang-1促进正常血管生长，Ang-2则上调与血管不稳定和炎症相关的异常因子，进而诱发新生血管的形成[43]。间充质干细胞表达Ang-1和高水平的Ang-2，具有很强的诱导损伤部位原有血管重构和支持新血管形成的能力[44]。由此推测，Ang-2与DR血管新生中的EndMT有关。

3.2脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV) CNV又称视网膜下新生血管，是来自脉络膜毛细血管的增殖血管，通过Bruch膜的裂口而扩展，于Bruch膜与视网膜色素上皮间或视网膜神经纤维层与视网膜色素上皮间或视网膜色素上皮与脉络膜间增殖形成[45]。湿性老年黄斑变性患者CNV的发展往往导致严重的视力丧失，当视网膜结构遭到破坏时，打破了血管生成因子与抑制因子的平衡，使血管生成因子占主导，从而引发新生血管以出芽方式在血管中生长[46-47]。

由于湿性老年黄斑变性视网膜血管系统受损，视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium，RPE)在缺氧条件下产生过量的VEGF是发生CNV的关键[48-49]。VEGF能够引起脉络膜内皮细胞的增殖和迁移[50]，破坏RPE细胞间的紧密连接[51]，从而使脉络膜血管长入视网膜下腔。作为一种正面的反馈，侵袭CNV位点的巨噬细胞和RPE细胞无限制地分泌趋化因子和细胞因子，从而加速血管新生[52]。因此，CNV血管生成涉及细胞因子、趋化因子和多个细胞(包括RPE、角膜内皮细胞和侵袭性巨噬细胞)的协同作用[53]。有研究表明，循环的骨髓来源的内皮前体细胞定位于新生血管的位置并分化为内皮细胞[54]。还有研究表明，CD133是人类造血前体干细胞和内皮祖细胞标志物[55]。一旦这些祖细胞分化为更成熟的内皮细胞，CD133的表达则降低[54]。此外，Harraz等[56]报道，CD14+单核细胞在体外可以分化为具有内皮细胞标志的细胞，在小鼠缺血性肢体中参与形成血管内皮。间充质干细胞作为骨髓基质细胞的主要细胞类型，可分化为内皮细胞和血管平滑肌细胞，并与新的血管壁结合参与血管的形成[57]。Hou等[58]发现，间充质干细胞可分化为内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞和RPE，这些细胞均参与CNV的发生。在间充质细胞中可检测到5种标志物的表达，即CD31、α平滑肌肌动蛋白、F4/80、波形蛋白和角蛋白[59]。间充质干细胞不仅能向血管内皮细胞转化[56]，还可以向结缔组织细胞转化[60]，说明间充质干细胞具有多向转化的潜能。因此，骨髓间充质干细胞在CNV中能分化为血管内皮细胞和血管外细胞。

4 小 结

内皮细胞和上皮细胞的表型转化参与多种生理、病理过程。EMT和EndMT在肿瘤转移及组织器官纤维化过程中的作用已受到广泛重视。在眼部疾病中，细胞表型转化同样参与多种病理转变。在FECD、后发性白内障、多种增殖性眼底病变中，EMT和EndMT参与组织纤维化、血管新生等过程。多种细胞因子参与间质转化，其中TGF-β是关键的启动因子，VEGF、成纤维细胞生长因子等也起关键作用。多种细胞因子通过转录因子调控信使RNA和DNA的表达，这一过程有多种信号通路参与。未来还应进一步了解细胞表型转化过程中涉及的分子机制、调控以及相关的信号通路，为眼科疾病的发病机制提供新的理论基础。