循环外泌体miRNA在胃癌临床诊疗应用中的研究进展

黄之野 综述 梁海滨， 陈 磊 审校

（上海交通大学医学院附属新华医院普外科，上海 200092）

胃癌是常见的恶性肿瘤，位居全球恶性肿瘤发病率第4位、癌症相关死亡第2位[1]。胃癌病人预后不良主要原因是确诊时已为晚期、化疗效果不理想等[2]。胃镜病理学检查是目前胃癌诊断金标准，但侵入性的缺点限制其作为胃癌筛查手段[3]。目前有许多非侵入性检测方法可用于胃癌诊断，如血清肿瘤标志物癌胚抗原 （carcinoembryonic antigen,CEA）、糖类抗原 199（carbohydrate antigen 199,CA199）、血清胃蛋白酶原等。但这些标志物特异度和灵敏度不高，胃癌早期诊断的应用受到限制[4]。因此，寻找特异度及灵敏度高的血清标志物是目前胃癌早期诊断的研究热点。化疗是进展期胃癌重要的治疗方式，但病人存在对化疗药物原发或继发的耐药性，因此对胃癌病人化疗耐药性的监测至关重要。

液态活检是检测病人外周循环体液，包括循环肿瘤细胞（circulation tumor cell，CTC）、血浆游离 DNA 和外周循环外泌体等[5]。外泌体是细胞分泌的双层膜性囊泡小体，包含蛋白质、信使 RNA（messenger RNA，mRNA）、微小 RNA（microRNA，miRNA）等多种生物活性分子，直径30～100 nm。外泌体是由内膜内吞形成的细胞内多囊泡体，后者与细胞膜融合后向胞外释放多个腔内囊泡[6]。几乎所有人体细胞都能分泌外泌体，并广泛存在于各种体液中。相比于正常细胞，恶性肿瘤细胞可分泌更多外泌体并释放入血。外泌体在形成过程中会选择性地装载miRNA等物质。多项研究表明，外周循环外泌体中富含肿瘤特异性miRNA，其在肿瘤发生、发展、转移、耐药过程中起重要作用。循环外泌体miRNA检测在胃癌临床诊疗应用中潜力巨大[7]。本文就近年循环外泌体miRNA在胃癌早期诊断、预后评估及化疗耐药性检测中的临床应用进展作一综述。

循环miRNA的生物学特性及来源

miRNA是一类内源性短链非编码RNA，长度18～25个核糖核苷酸。miRNA分子通过与靶mRNA的3′段非编码区互补结合，使靶mRNA降解或沉默，从而抑制蛋白质的合成，是转录后基因表达调控的关键分子[8]。2008年，Mitchell等[9]首次在人体外周血中发现稳定存在的miRNA，且发现循环miRNA具有作为前列腺癌标志物的潜力。近年来循环miRNA作为各类疾病标志物的研究备受关注。

循环miRNA的来源、产生机制，以及稳定存在于血液中的机制一直是研究热点。综合已有的研究分析，循环miRNA的来源主要有以下途径：①活细胞的主动分泌。包括以外泌体、微泡或与AGO蛋白2（argonaute protein 2）核糖蛋白结合形成复合体的形式分泌并稳定存在[10]。Arroyo等[10]研究表明，核糖体AGO蛋白2复合体是循环miRNA的主要存在形式，然而也有研究表明，血清中的miRNA更多存在于外泌体中[11]。②坏死或凋亡细胞的被动分泌[12]。原位肿瘤细胞发生凋亡或坏死时会释放出胞质内的miRNA等物质入血，形成循环游离 miRNA（circulation free RNA，cfRNA）。 此外，肿瘤细胞通过上皮-间质转换过程侵入血管内皮从而进入血液循环，即CTC。CTC入血后存活时间短，随后发生溶胞作用，释放出miRNA等物质，从而形成cfRNA[12]。

目前检测循环miRNA的常用方法包括微阵列芯片、RNA测序、Northern印迹杂交和定量 RT-PCR（quantitative RT-PCR，qRT-PCR），但这些方法并不能区分循环miRNA的来源。相比其他来源的循环miRNA，循环外泌体miRNA更有优势。研究表明，外泌体在形成过程中会选择性地装载miRNA等物质。不同肿瘤细胞分泌的外泌体中包含不同比例、不同种类的miRNA。外泌体可通过与受体细胞膜融合，转运其携带的生物活性物质，介导细胞间的信号交流与物质传递，调控肿瘤细胞增殖转移、侵袭耐药等行为[7]。同时外泌体miRNA检测可在肿瘤细胞凋亡和坏死之前进行。因此，循环外泌体miRNA检测更适合应用于临床肿瘤的早期诊断和预后评估[13-14]。

循环外泌体miRNA作为胃癌诊断的标志物

胃癌起病隐匿，早期症状不明显，不易发现，进展期易发生转移，预后较差。胃癌防治的关键在于能否早诊断早治疗[2]。多项研究表明，循环外泌体miRNA有潜力成为胃癌诊断新型标志物。

慢性萎缩性胃炎被视为胃癌癌前病变。Liu等[15]研究表明，循环外泌体miRNA可作为慢性萎缩性胃炎的无创性诊断方法。该研究采用二代测序分析，比较30例慢性萎缩性胃炎与30例慢性非萎缩性胃炎病人血清外泌体miRNA表达谱，筛选出10个有表达差异的候选miRNA，并通过qRTPCR进一步验证这60例病人。最终发现血清外泌体hasmiR-122-5p在慢性萎缩性胃炎病人中显著高表达。绘制受试者工作特征 （receiver operating characteristic，ROC）曲线后，求得ROC曲线下面积 （area under curve，AUC）值为0.67，特异度86%，灵敏度62%。这些结果表明血清外泌体has-miR-122-5p有望成为诊断GC癌前病变的新型标志物。

也有学者尝试将循环外泌体miRNA作为胃癌诊断标志物。Shi等[16]综合分析两个高通量基因表达数据库后，发现6个候选循环miRNA在胃癌病人中高表达，通过qRT-PCR发现循环miR-1246表达差异性最大。体外实验表明，肿瘤来源的miR-1246在胚胎致死异常视觉样蛋白1（embryonic lethal abnormal vision like 1,ELAVL1）的帮助下以外泌体的形式存在于循环中。在包含85例胃癌和50例健康人群的血液样本中检测其诊断效能，其AUC为0.91，特异度86%，灵敏度82%。进一步检测28例TNMⅠ期胃癌、50例健康人和30例胃良性疾病病人的血液样本，发现循环外泌体miR-1246表达水平可区分TNMⅠ期胃癌病人与非胃癌人群（健康对照和胃良性疾病），其AUC值分别为0.84（特异度74%，灵敏度85%）和0.81（特异度80%，灵敏度78%）。Yang等[17]使用qRT-PCR检测80例胃癌病人和80例健康人群血清中4个候选外泌体miRNA的表达。结果发现，外泌体miR-423-5p在胃癌病人的血清中显著高表达。为更好地探究该miRNA的临床价值，进一步比较循环外泌体miR-423-5p与常见的血清肿瘤标志物CEA和CA199的诊断价值。结果表明，循环外泌体miR-423-5p、CEA和CA199的AUC值分别为 0.76（特异度 57%，灵敏度 81%）、0.60和 0.61（后两个均未给出特异度和灵敏度），miR-423-5p具有较高的诊断效能。另外还报道，循环外泌体 miR-135b[18]、miR-23b[19]、miR-107[20]、miR-1290[21]、miR-451[22]也具有成为胃癌诊断生物标志物的潜在价值。

然而，考虑到单个miRNA可调控多个基因表达，同时也可能参与多种肿瘤发生、发展，因此，采用单个miRNA诊断胃癌的特异性欠佳，可能联合多个miRNA作为诊断标志物效能较好。Wang等[23]首先在20例胃癌病人和20例健康人血清样本中采用qRT-PCR筛选出4种差异性表达的循环外泌体miRNA。随后在90例胃癌病人和90例健康人血清样本，获得2个有意义的循环外泌体miRNA（miR-19b和miR-106a），单独诊断的AUC值分别为0.79和0.77，两者联合诊断的AUC值达到0.81（但未给出特异度和灵敏度）。为进一步检验其诊断价值，Wang等[23]对这2种miRNA进行双盲检测，在20例胃癌病人和20例健康人血清样本的验证中，循环外泌体miR-19b和miR-106a联合诊断正确区分胃癌19例（灵敏度95%），健康人 18例（特异度 90%）。Huang等[24]用相似的研究方法鉴定发现6种miRNA在病人血清中高表达， 其中 4 种 miRNA（miR10b-5p、miR195-5p、miR20a-3p、miR296-5p）主要以外泌体的形式存在于外周血。尽管单独诊断的AUC不高，6种血清miRNA联合检测的AUC达到0.70（均未给出特异度和灵敏度），但未评估4种外泌体miRNA联合检测诊断效能。

综合现有报道，目前对于循环外泌体miRNA应用于胃癌早期诊断的研究仍较少，在研究方法（如未与金标准胃镜活检病理学诊断进行盲法比较，未设置对照，未确认正常值等）和病例选择（数量少且缺乏代表性）等方面仍有缺陷，说明循环外泌体miRNA与临床应用尚有很大距离。此外，多种细胞在正常生理或病理状态下均能分泌外泌体，如何区分生理性和病理性外泌体以及判断是否为肿瘤来源的外泌体仍需要更多研究。因此，循环外泌体miRNA只能作为胃癌早期诊断辅助指标或与其他无创检测指标联合提高诊断效能。但因其方便、可重复、高特异性的优势，循环外泌体miRNA作为胃癌早期诊断的新型生物标志物仍具有研究价值。

循环外泌体miRNA在评估胃癌预后中的价值

最近，越来越多的研究已证实，循环外泌体miRNA与胃癌治疗效果和预后、复发有关联性。Kumata等[19]研究表明，循环外泌体miR-23b可作为评估胃癌病人各肿瘤分期预后的独立危险因素，且可一定程度预测胃癌病人术后复发。Kumata等[19]通过基因芯片技术检测3例胃癌术后复发病人、3例胃癌术后未复发病人和3例健康人血清样本，发现胃癌术后复发病人外泌体miR-23b显著低表达。进一步研究将232例不同肿瘤分期胃癌病人分为外泌体miR-23b高表达与低表达两组，发现外泌体miR-23b表达与肿瘤大小、侵袭度、淋巴结转移、肝转移以及TNM分期之间存在关联。在预后方面，研究者分析病人各肿瘤分期的总生存（overall survival，OS）及无病生存（disease-free survival，DFS）。 单变量及多变量分析显示，循环外泌体miR-23b低表达在各肿瘤分期中都是预后不良的独立危险因素。

另一项研究证实循环外泌体miR-451可预测胃癌病人预后[22]，且验证循环外泌体miR-451来自于胃癌组织。Liu等[22]检测76例胃癌病人的癌组织、癌旁组织和循环外泌体，发现miR-451在癌组织中显著低表达，在癌旁组织浸润的T细胞和循环外泌体中显著高表达。随后将胃癌病人分为循环外泌体miR-451高表达组和低表达组，并分别绘制生存曲线，发现高表达组预后显著较差，5年生存率为15.90%[风险比（hazard ratio,HR）=4.34]。进一步线性相关分析表明，癌组织miR-451表达水平与肿瘤浸润T细胞中表达水平呈负相关，循环外泌体miR-451表达水平与肿瘤浸润T细胞中表达水平呈正相关，从而提出肿瘤可能通过外泌体的形式向肿瘤周围组织和外周血分泌miR-451，诱导肿瘤浸润辅助性T细胞17（T helper cell 17,Th17）分化，从而在肿瘤发生、发展中发挥作用。

Bai等[18]研究表明，胃癌细胞分泌的外泌体miR-135b通过抑制内皮细胞叉头蛋白家族O亚群蛋白1（forkhead boxcontaining protein,O subfamily1,FoxO1）的表达，促进肿瘤周围血管生成。该研究通过检测3 951例GC组织中FoxO1 mRNA水平并绘制生存曲线，发现FoxO1 mRNA低表达的胃癌病人总体生存率明显下降。运用生物信息分析工具筛选出FoxO1上游的潜在调节miRNA，结合病人癌组织及循环外泌体中miR-135b均高表达，最终确定外泌体miR-135b可通过调控FoxO1表达影响胃癌预后。然而循环外泌体miR-135b可否作为病人预后的预测指标仍待进一步研究。

另外，还有多项研究指出，胃癌病人循环外泌体miRNA表 达 水 平 与 淋 巴 结 转 移 （miR-423-5p[17]、miR-19b[23]、miR-106a[23]）、TNM 分 期 （miR-19b[23]、miR-106a[23]、miR-1246[16]、miR-221[25]）、远处转移（miR-1246[16]）等影响预后的因素有关联。然而目前关于循环外泌体miRNA在胃癌预后预测方面的研究有缺陷。其所选定病人处于不同病程阶段，随访时间不充足，结局未采用盲法，未进行校验等。因此还需进一步研究。以上研究结果表明，循环外泌体miRNA具有预测胃癌预后的潜力。

循环外泌体miRNA评估胃癌化疗敏感性

目前也有关于循环外泌体miRNA预测胃癌化疗敏感性的研究。魏玮等[26]采用二代测序对6例以氟尿嘧啶为基础化疗的耐药胃癌病人血清进行检测，比较病人化疗前及耐药后的血清外泌体miRNA表达水平，筛选出上百个具有显著表达差异的miRNA，提出以下可能性。通过晚期胃癌血清外泌体miRNA表达的检测预测和实时监测化疗耐药性，并对相应靶基因进行干预。Zheng等[27]研究发现，肿瘤相关巨噬细胞来源的外泌体可将miR-21转运至胃癌细胞中，从而促进胃癌细胞对顺铂产生耐药。尽管循环miR-21作为胃癌诊断标志物早有报道[28]，但循环外泌体miR-21能否用于临床检测胃癌病人化疗耐药性仍需进一步探索。Wang等[29]采用qRT-PCR检测顺铂耐药胃癌细胞系中miR-214表达水平，发现耐药细胞miR-214显著高表达。在此基础上制备出含有抗miR-214的外泌体，在分子、细胞和动物水平上验证含有抗miR-214的外泌体可逆转胃癌细胞对顺铂的耐药性，为难治性胃癌提供潜在替代方案。这些研究说明循环外泌体miRNA在化疗敏感性预测和实时监测方面具有巨大潜力，但同样存在研究例数较少、缺乏验证等缺陷，需进一步努力研究。

综上所述，循环外泌体miRNA在胃癌的早期诊断、预后评估及化疗耐药性监测中具有潜在应用价值（见表1）。

思考与展望

循环外泌体miRNA检测便捷、创伤小、可重复、稳定性高的优势使其临床意义显著。外泌体作为细胞间交流的重要物质，与肿瘤发生、发展、侵袭、转移、化疗耐药等生物学过程密切相关。因此，循环外泌体miRNA在胃癌早期诊断，预后评估、化疗监测、作为基因治疗靶向载体等方面均有良好的临床应用前景。

表1 循环外泌体miRNA在胃癌临床诊断、预后、化疗耐药性中的研究

然而目前关于循环外泌体miRNA的临床应用仍存在诸多不足，如目前针对胃癌循环外泌体miRNA的检测例数和纳入研究范围仍有缺陷。在不同发病阶段、不同胃癌病理分型、不同分期、手术前后及化疗前后，胃癌病人循环外泌体miRNA量与质的变化规律等方面仍需进一步临床研究。目前发现的存在表达差异的循环外泌体miRNA缺少针对肿瘤的特异性，一种miRNA在多种肿瘤中都有表达，仅检测一种miRNA，其特异度和灵敏度不高。联合多个miRNA甚至其他肿瘤指标可大大提高诊断价值，可能是今后研究方向。循环外泌体miRNA含量较少，检测难度较大，检测成本较高，寻找成本适中且成熟可靠的循环外泌体miRNA检测技术，提高其应用于临床的可行性，仍需探讨。目前关于外泌体miRNA的基础研究较多，将基础研究成果转化成真正的诊疗手段还有待进一步探索。随着基础理论与临床应用研究的不断深入和发展，循环外泌体miRNA应用于癌症诊治的价值终将实现。