肾动脉移植骨髓间充质干细胞对阿霉素肾病大鼠肾纤维化的影响

杨 扬， 王家平， 万珊杉， 李天祎， 杨素萍

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）患病率逐年增高，调查显示全球总患病率为10.8%，我国就有约1.195亿CKD患者［1］。CKD是由多种原发性或继发性肾脏疾病持续性发展而来，随着病程进展，出现肾小球硬化及肾间质纤维化病理改变，临床上表现为肾小球滤过率进行性下降，尿蛋白显著增加，最终肾衰竭，治疗方式仅为透析或肾脏移植，手段有限。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）作为再生医学中修复损伤组织和脏器的种子细胞，能够靶向归巢至受损组织及炎症部位，通过直接分化为肾脏固有细胞、旁分泌多种细胞因子促进血管再生，减少足细胞损伤并延缓肾脏纤维化，对受损肾组织发挥积极的修复作用［2-5］。然而不同的BMSC移植途径将直接影响其归巢至受损肾组织的数量，从而影响其对受损肾脏的修复作用。本研究旨在评估经肾动脉移植BMSC对阿霉素肾病大鼠受损肾组织的修复作用及对肾脏纤维化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

50只清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠由昆明医科大学动物中心提供。2只为4周龄，用于体外分离培养BMSC；48只16周龄，用作实验分组，体质量（356±18）g，其中36只用于构建CKD动物模型，12只为正常对照组。主要试剂：胎牛血清（FBS）和低糖培养基（L-DMEM）（美国Gibco公司），阿霉素（美国Sigma公司），青链霉素双抗和0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化液（北京索莱宝科技公司）。

1.2 阿霉素慢性肾病动物模型构建和实验分组

购进大鼠后适应性喂养1周，期间予以自由饮食。固定大鼠，经尾静脉注射阿霉素，第1次剂量为3 mg/kg，间歇14～20 d予以相同剂量第2次注射，之后每周尾静脉采血测血肌酐、血尿素氮水平，收集24 h尿液检测24 h尿蛋白含量，以血肌酐、血尿素氮和24 h尿蛋白水平升高，肾脏病理切片苏木精-伊红（HE）染色示慢性肾病改变为造模成功标准，平均时间约为7周。将造模成功大鼠随机分为3个组：模型组（CKD组）、经尾静脉移植BMSC组（V-M组）和经肾动脉移植BMSC组（A-M组），每组各12只；剩余12只健康大鼠为正常对照组（N组），经尾静脉输注等量0.9%氯化钠溶液。

1.3 BMSC体外分离培养

采用全骨髓贴壁培养法分离纯化大鼠BMSC。2只4周龄清洁级SD大鼠，体质量80 g，脱颈处死，75%乙醇全身浸泡10 min，0.9%氯化钠溶液冲洗干净；超净工作台下取双侧股骨、胫骨，剔除肌肉等组织，剪去骨骺端，暴露骨髓腔，用5 mL注射器抽取磷酸缓冲液（PBS）冲洗骨髓腔3～5次，直至观察到骨髓腔变白；收集骨髓腔冲洗液于离心管中，充分吹打混匀，100 μm细胞筛过滤后，1 500 r/min离心5 min，轻轻倒去 PBS，用含 10%FBS、1%青链霉素双抗的L-DMEM重悬细胞，再次充分吹打混匀，制成单细胞悬液，接种至T25细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育；48 h后首次换液，以后每隔3 d换液1次。待细胞生长融合达90%～100%时，用 0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化细胞，按 1∶4比例传代。取P3代细胞进行成骨、成脂诱导分化培养，流式细胞仪行细胞表面抗原鉴定。

1.4 不同途径移植BMSC

将生长状态良好、融合度达100%的BMSC用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，倒置相差显微镜下见细胞呈圆形后加入L-DMEM培养基终止消化，1 500 r/min离心5 min，弃上清液，PBS重悬细胞，充分吹打混匀制成单细胞悬液，细胞计数器计数细胞，调整单细胞悬液成2×106个/mL，冰盒保存备用。A-M 组大鼠：10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台，剃除颈部毛发，聚维酮碘消毒，铺无菌手术单；充分暴露颈部，正中做约4 cm垂直切口，钝性分离出左颈总动脉，眼科剪在左颈总动脉作T字型切口，参照文献［6］方法插入PE10导管，DSA下动态观察，直至导管推送至右肾动脉，注射少量对比剂证实后推注500 μL BMSC悬液；术毕结扎左颈总动脉，逐层缝合颈部手术切口，肌内注射抗生素预防感染，将大鼠放置保温箱中，密切观察，待其自然清醒后归笼继续饲养。

V-M组大鼠：经尾静脉注射等量BMSC悬液。CKD组大鼠：经尾静脉注射等量PBS。N组大鼠：经尾静脉注射等量0.9%氯化钠溶液。

1.5 样本收集与检测

分别于移植BMSC后第7、14天，将各组大鼠放入代谢笼内，收集24 h尿液，尾静脉采血分离血清；采用Chemray 240型全自动生化分析仪检测24 h尿蛋白、血肌酐和血尿素氮水平。移植BMSC后第14天处死各组大鼠，快速取肾，固定脱水后制成5 μm石蜡切片，行HE染色和Masson三色染色，观察肾脏结构病理改变及纤维化情况。纤维化评分标准：根据病变由轻至重程度，依次半定量评估，极少量或无病变为“-”记 0，轻度或少量“+”记 1，中度或中等量“++”记 2，重度或多量“+++”记 3，极重度或大量“++++”记 4。

1.6 统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较用重复测量资料方差分析，两两比较用最小显著性差异t检验，检验水准 α=0.05。

2 结果

2.1 BMSC 分离、纯化和鉴定

倒置相差显微镜下见大鼠BMSC呈多角形、梭形，“鱼群状”或“旋涡状”贴壁生长。成骨诱导培养28 d后行茜素红染色，可见被染成橘红色的钙结节；成脂诱导培养20 d后行油红O染色，可见被染成红色的脂滴（图 1）。P3代 BMSC表面抗原CD11b、CD45、CD29、CD90 表达率分别为 2.23%、1.94%、99.98%、99.97%。

图1 倒置相差显微镜下大鼠P3代BMSC及诱导分化培养结果

2.2 BMSC移植治疗结果

与N组相比，CKD组、V-M组、A-M组血肌酐、血尿素氮、24 h尿蛋白均显著升高（P＜0.01）。 移植BMSC后第7天，与CKD组比较，V-M组、A-M组24 h尿蛋白均降低（P＜0.05），且 A-M 组低于 V-M组（P＜0.05）；V-M 组血肌酐、血尿素氮与 CKD 组相比无明显改善，但A-M组较CKD组改善明显（P＜0.01）。 移植 BMSC后第 14天，V-M 组血肌酐、血尿素氮较CKD组有所下降，差异无统计学意义（P＞0.05），但 A-M 组与 V-M 组、CKD 组相比下降明显 （P＜0.05）；V-M 组、A-M 组 24 h尿蛋白水平仍低于 CKD 组，但差异无统计学意义（P＞0.05）（表 1）。

2.3 肾组织HE染色和Masson三色染色结果

N组肾组织HE染色未见明显病理改变，肾小球大小和形态均一、正常，基底膜正常，间质无炎性细胞浸润，肾小管无萎缩；Masson三色染色未见胶原纤维沉积，评分0分。CKD组HE染色见大量肾小管间质炎性细胞浸润伴结缔组织增生，肾小管萎缩，管腔变小，基底膜增厚，肾小囊腔扩张，大量肾小球损伤，毛细血管扩张并出现空泡、系膜增厚、细胞减少，呈局灶节段性硬化改变；Masson三色染色见大面积肾小管间质及肾小球囊周围胶原增生，纤维化评分为3分。V-M组HE染色见较多肾小管间质炎性细胞浸润伴结缔组织增生，肾小管扩张，上皮细胞扁平化，腔内充满蛋白液，形成肾小管管型，部分肾小管萎缩，基底膜增厚，个别肾小球坏死；Masson三色染色见肾小管间质纤维增生，评分为2分。A-M组HE染色见少量肾小管间质炎性细胞浸润伴少量结缔组织增生，部分肾小球出现囊腔扩张，空泡变性及毛细血管扩张程度下降，肾小管萎缩数量减少，基底膜存在不同程度增生，少量肾小管内充满嗜酸性蛋白液形成管型；Masson三色染色可见少量蓝色着染胶原纤维，评分为1分，见图2。

表1 移植BMSC后各组大鼠血肌酐、血尿素氮、24 h尿蛋白值比较 n=12

图2 各组大鼠肾脏HE染色和Masson三色染色病理图片（×200）

3 讨论

阿霉素经注射后主要累积在肾脏，氧化后产生大量氧自由基，在多种活化因子作用下能诱导肾小球上皮细胞损伤，破坏滤过膜，从而造成肾脏损伤。这是经典的肾病模型构建方法。根据造模时间和给药次数不同，可分为急性肾病模型和慢性肾病模型［7］。急性肾病模型造模时间较短，单次大量注射阿霉素后4周左右即可成模型，病理类型为微小病变型肾病，类似人类肾病综合征；慢性肾病模型造模时间相对较长（＞5周），且需多次给药，病理类型为局灶节段性肾小球硬化型肾病，类似人类慢性肾小球肾炎。值得注意的是，阿霉素亦对其他脏器有强烈的毒性作用和不良反应，实验过程中引起造模大鼠死亡的原因主要有胃肠出血、肠胀气、腹水、心肌损伤及肺肿瘤等［8］，这与给药剂量和给药间歇时间密切相关。本研究中采用尾静脉注射阿霉素造模，首次剂量为3 mg/kg，间歇14～20 d以相同剂量再次给药，约7周成功建立CKD模型。与大剂量（＞4 mg）、间歇1周再次给药的造模方法相比，在造模时间相近前提下，显著降低了大鼠死亡率，有效保证了实验动物数量，而与单侧肾切除联合阿霉素注射法相比，该法操作简单，效率较高。

目前，BMSC已被证实对慢性肾病确有一定的治疗作用，但具体机制尚不清楚。研究表明，注射BMSC能显著改善CKD大鼠肾功能，肾脏损伤程度较小的2/3肾切除组治疗效果优于损伤程度重的5/6肾切除组，经BMSC处理后巨噬细胞（ED-1阳性细胞）数、α-平滑肌肌动蛋白（SMA）及增殖细胞核抗原（PCNA）表达显著降低（P＜0.01），Masson 染色示肾间质纤维化和肾小球硬化程度下降，提示早期进行 BMSC干预 CKD大鼠治疗效果更优［9］。Villanueva等［10］等研究结果与上述研究一致，不同的是其采用尾静脉单次移植BMSC，结果表明BMSC可增强肾脏修复过程，显著改善肾功能，并发现血管生成标志物血管内皮细胞生长因子（VEGF）和血管生成素家族受体Tie-2表达增加，推测BMSC对CKD受损肾组织的修复作用可能与诱导肾血管生成途径有关。白彝华等［11］通过颈动脉肾动脉插管输注BMSC至阿霉素CKD大鼠受损肾组织，发现血肌酐、尿素氮明显下降，血红蛋白显著升高，肾脏HE染色示BMSC处理组大鼠肾组织中炎性细胞浸润程度下降、范围减小，提示经肾动脉移植BMSC有助于CKD肾组织修复。上述研究均表明BMSC对CKD具有治疗作用，观察指标主要是肾功能测定，如血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白、血清白蛋白等变化，而与CKD疾病后期发展至肾脏纤维化有关的文献报道并不多。本研究通过对比尾静脉和肾动脉两种途径移植BMSC治疗阿霉素CKD大鼠发现，两种途径均对受损肾组织发挥修复治疗作用，移植后第7天V-M组、A-M组24 h尿蛋白与CKD组比较均降低（P＜0.05），且A-M组低于V-M组（P＜0.01），一直至第14天 A-M组、V-M组24 h尿蛋白水平仍低于CKD组；A-M组血肌酐、尿素氮水平较CKD组、V-M组下降，说明在移植BMSC后一段时间内，经肾动脉移植BMSC对CKD大鼠治疗效果优于经尾静脉移植；各组大鼠肾脏HE染色和Masson三色染色分析发现，BMSC干预可减少CKD大鼠肾组织炎性细胞浸润，萎缩肾小管数量减少，扩张肾小管趋于正常，基底膜虽然仍存在不同程度增生，但与CKD组相比，BMSC干预后情况有所改善；随着病程延长，大鼠肾纤维化程度加深，主要表现为肾间质纤维化和肾小球硬化，Masson染色见CKD组肾组织出现大面积蓝染物质沉积于肾间质和肾小球囊周围，而移植BMSC后发现肾组织中蓝染面积缩小，着色程度减轻，说明BMSC移植治疗能减轻或延缓CKD大鼠肾脏纤维化，修复肾组织。

综上所述，BMSC移植疗法可修复CKD大鼠受损肾组织，且在一定时间内，肾动脉途径移植治疗效果要优于尾静脉途径，可能与干细胞归巢至肾组织数量有关［6］。此外，BMSC可抑制或延缓肾脏纤维化，并发挥积极的治疗作用，但具体作用机制尚不清楚。有研究提出细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度沉积，可能是导致肾间质纤维化和肾小球硬化的原因，肾间质纤维化由ECM在基底膜和管周毛细血管之间沉积导致，肾小球硬化则可能是内皮细胞或足细胞代谢，机械或免疫损伤引起ECM在肾小球系膜细胞中增加所致［12］。但本研究未涉及信号通路、分子机制研究，有待于进一步研究证实。