马铃薯组培苗内生菌治理方法研究

张秋萍 黄醒师 贡 剑 邹玉兴 居玉玲

（1江阴市农业技术推广中心，江苏省无锡市 214405；2江阴沃土农业生物科技开发有限公司，江苏省无锡市 214415；3江阴市种子管理站，江苏省无锡市 214400）

目前，我国马铃薯种植面积达5×106hm2以上，对脱毒种薯的需求非常大，脱毒微型种薯（即原原种）也因此成为保证马铃薯高产的基础。虽然国内规模化生产马铃薯组培苗继而生产马铃薯原原种的企业相当普遍，但在马铃薯组培苗规模化生产中，组培苗易受内生菌感染的问题一直困扰着众多的生产者和研究者，若对内生菌处置不当，不仅会影响马铃薯组培苗的质量和数量，还会直接影响马铃薯组培苗的生产计划安排，进而造成生产单位人、财、物的极大浪费。据文献报道，马铃薯组培苗内生菌的杀菌方法基本上是在培养基中添加杀菌剂，但绝大部分杀菌剂处理的时效有限，且对后续组培苗的继代繁殖也有一定影响。鉴于此，笔者拟进行马铃薯组培苗内生菌治理方法试验研究，以期找到有效根除马铃薯组培苗内生菌的方法。

1 材料与方法

1.1 菌源判断

马铃薯组培苗内生菌分离培养后，经南京理工大学环境与生物工程学院进行鉴别，其分类地位可能为革兰氏阴性菌寡养单胞菌属Stenotro phomonassp.（包括有8个种，侵染马铃薯组培苗的内生菌是其中的一种）。其广泛存在于土壤、尘土、淡水、湖泥、植物根系、农副产品、人和动物的体表及消化道中，最适生长温度为35 ℃，在4 ℃条件下不生长，近半数菌株在42 ℃时生长，为专性需氧菌，对营养的要求不高，在普通琼脂平板上即可生长良好。

1.2 品种、试剂与器具

供试马铃薯品种为“费乌瑞它”（Favorita）。试验试剂为0.1%升汞（HgCl2）和10%次氯酸钠（NaClO）。培养器皿为瓶底直径6 cm、瓶高9 cm、没有瓶肩的直口瓶，容积为250 mL，每个培养瓶接种16株苗，瓶盖采用封口膜和硫酸纸棉绳绑扎封口；其他器具包括若干个小烧杯（每个处理配备1个烧杯，用于升汞处理）、存放废弃水的大烧杯、剪子、镊子、剥离专用针、手术刀、无菌水（用三角瓶装纯净水，不能太满，占容器的1/3，灭菌后备用，pH不超过7，EC值在20以下）、滤纸（装入培养皿内）、培养皿、器械手术刀和专用工具。烧杯均用牛皮纸或报纸包好，放入高压灭菌锅内灭菌，所有器具均提前灭菌，在操作前送往超净工作台。

1.3 供试材料选择试验

将感染内生菌的马铃薯组培苗植株，分上、中、下部三段茎段剪下，其中，最上面的部位是2叶1心带生长点的茎段；中间部位是剪去生长点后，下面带1片叶的中间茎段；下面部位是靠近根部上方带1片叶的茎段。上述茎段分别扦插在MS培养基上（培养基在高压121 ℃条件下灭菌18～19 min，缓冲间冷却后，送至无菌室），每个部位转接30瓶，生长8 d后，观察内生菌的分布情况。

1.4 内生菌处理试验

在1.3观察的基础上，选取感染内生菌最轻的茎段（2叶1心带生长点）作供试材料，分别用0.1%升汞和10%次氯酸钠浸泡处理，共设4个不同时间段：（1）100 s、（2）110 s、（3）120 s、（4）140 s，另设一个不做任何处理的对照（CK）。每处理均接种30瓶。

试剂处理时，将剪下的茎段浸泡在试剂内，并不断晃动，使试剂作用到茎段的每个部位，再用无菌水清洗4～5次，将茎段放在经高压灭菌过的滤纸上吸干水（滤纸在使用前，用镊子夹住，在酒精灯上转圈烤一下，以充分吸走外植体上的水分，降低污染率），然后插在灭菌过的培养基上，送至培养室培养，8 d后观察杀菌效果及各处理对组培苗生长的影响（鉴于杀灭内生菌的化学试剂对组培苗正常细胞也有损伤，故需观察统计组培苗叶片上的枯斑点）。

2 结果与分析

2.1 供试材料选择

由表1可知，马铃薯组培苗植株三个部位均感染内生菌，故内生菌随着植物细胞共同生长。组培苗不同部位的茎段均会感染内生菌，仅是菌落大小有所差异，其中以含2叶1心生长点的茎段感染内生菌的程度最轻。

表1 组培苗不同部位的茎段上内生菌分布情况

2.2 内生菌处理

由表2可知，对照无干净瓶苗，处理（1）的干净瓶苗率为87%，其余3个处理的干净瓶菌率均为100%，但处理（3）、（4）的组培苗叶片有损伤，故以处理（2）为最佳处理时间。由表3可知，4个处理和对照均无干净瓶苗，且4个处理的组培苗叶片均有不同程度的损伤，表明10%次氯酸钠的杀菌效果远逊于0.1%升汞。在实际的马铃薯规模化生产中，为杀灭内生菌，宜采用0.1%升汞处理马铃薯组培苗110 s。

表2 0.1%升汞的杀菌效果和对组培苗生长的影响

3 结论与讨论

3.1 结 论

试验结果表明，含2叶1心生长点的茎段，是整个马铃薯植株感染内生菌程度最轻的部位，也是治理马铃薯组培苗内生菌最合适的切入点；同时，既能杀死内生菌、又对马铃薯组培苗没有损害的最佳药剂为0.1%升汞，最佳处理时间为110 s；10%次氯酸钠的杀菌效果不够理想，且对植株有伤害。

表3 10%次氯酸钠的杀菌效果和对组培苗生长的影响

3.2 讨 论

通过对2004年以来有关文献的搜索，以及笔者自身多年的试验摸索，一直没有发现彻底根除马铃薯组培苗内生菌的有效方法，且一般在茎尖剥离中，通常用0.1%升汞对外植体进行灭菌，而直接用于组培苗茎段灭菌的尚未见有文献报导。本试验用0.1%升汞处理组培苗上部茎段110 s，能起到根除马铃薯组培苗内生菌的效果，同时，根据笔者的实践，即使经过多代的继代繁殖，只要没有环境因素和操作因素的影响，就不会有内生菌再感染。因此，用0.1%升汞（HgCl2）浸泡马铃薯组培苗110 s，是目前根除马铃薯组培苗内生菌的有效方法，本方法可应用于马铃薯组培苗的规模化生产。

通常内生菌的早期感染是从根部开始发现，不仔细观察不易发现，且植株茎叶生长很正常，但若继续进行组培苗扩繁，内生菌的感染会越来越明显，造成整个根部出现黄色菌脓，继续扩繁最终会发生不长根烂苗，造成毁灭性损失。因此，需在感染早期加以识别和剔除。可通过一看二闻三观察识别是否感染内生菌，即：一看是看瓶底组培苗根部是否有内生细菌污染；二闻是打开瓶盖闻，有内生菌感染的瓶苗会闻到细菌侵染的酸味；三观察是仔细观察植株根部是否有牛奶状的乳白色液体小点，若发现需及时挑出。

此外，防治马铃薯组培苗感染内生菌，还需切实采取以下综合措施：（1）在留基础苗时，选择根系干净的健康苗；（2）在培养生长时，注意光照强度和长度，昼夜要有温差，光照需充足，强光照可有效抑制内生菌的发生；（3）无菌室和超净工作台需保持洁净，接种器械包括电子灭菌器内的石英珠，每天要洗干净并进行高压灭菌；（4）操作人员衣帽干净，戴上口罩，在无菌室不能大声喧哗（以防口腔菌感染培养基），严格按照分苗操作规程进行灭菌、操作；（5）采用反复茎尖培养或分生组织培养的方法来脱除内生菌。