基于硼酸及硼酸酯的细胞器靶向过氧化氢荧光探针的研究进展

毕雪源，查晓明

(中国药科大学 工学院，江苏 南京 211198)

在含氧代谢过程中，需氧生物产生各种活性氧(ROS，reactive oxygen species)。活性氧包括超氧化物(O2·-)、臭氧(O3)、脂质过氧自由基(ROO·)、单线态氧(1O2)、次溴酸/次溴酸盐(HOBr / BrO-)、次氯酸/次氯酸盐(HOCl / ClO-)、一氧化氮(NO)、羟基自由基(·OH)，过氧亚硝酸盐(ONOO-)、过氧化氢(H2O2)等[1-3]。H2O2是最重要的活性氧家族之一，对许多生理和病理过程具有重要的调节作用，包括细胞信号传导，调节细胞增殖，免疫防御机制，细胞凋亡，迁移和分化等过程[4-12]。在细胞中，H2O2主要是通过激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adeninedinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶复合物在线粒体中产生的，但也源自内质网(endoplasmic reticulum，ER)和各种氧化酶[13-16]。重要的是，细胞内不同浓度的H2O2会极大地影响其生物学功能。通常情况下，健康细胞中H2O2的生理浓度范围为1到105nM[17]。H2O2的过量积累可能对身体有害，从而导致一系列疾病，例如癌症，炎症和细胞损伤[18-20]。低生理浓度的H2O2可以触发细胞凋亡并促进氧化应激。H2O2在生物系统中起着不可或缺的作用[21]。因此，有必要开发有效的方法来灵敏地检测各种条件下H2O2的浓度和分布。

最近，已经报道了许多检测H2O2的方法，包括荧光标记法、电化学传感器、分光光度法、化学发光法、滴定法、色谱法、光检测法[22-28]。其中，荧光标记法具有更多的优点，包括优异的选择性、良好的灵敏度、方便的应用、低成本、实时和可视化的特点。因此，研究人员将注意力集中在开发用于对人类健康和临床前诊断进行H2O2成像的荧光探针上。近来，许多基于芳基硼酸酯或苯基硼酸氧化反应的荧光探针已被设计用来监测活细胞和组织中的H2O2，因为它们对H2O2的选择性性高于其他ROS。早在1957年，就在水溶液中研究了H2O2对芳基硼酸的传感机制(图1)。亲核的H2O2进攻亲电的芳基硼酸酯形成不稳定的中间体，该中间体水解后可定量生成苯酚和硼酸[29]。由于H2O2的功能在很大程度上取决于亚细胞区室。考虑到这些需求，设计并合成了一些具有细胞器靶向能力的H2O2荧光探针。

图1 基于芳基硼酸酯官能团的荧光探针对H2O2的识别机理

2 具有细胞器靶向的荧光探针研究进展

线粒体是重要的细胞器，被认为是活细胞中H2O2的主要来源[30-31]。因此，开发了线粒体靶向的H2O2探针，用于H2O2的定量分析。由于线粒体膜的电势通常为-180 mV，带有阳离子的染料可以很容易地穿透线粒体膜，然后在其内部积累[32]。带正电的基团，例如三苯基磷基团(triphenylphosphonium，TPP)(图2)，氮正离子和氧鎓离子(图3)表现出优异的线粒体靶向特征。2008年，Chang等人以带正电的作为靶向基团，设计了第一个线粒体定向的H2O2荧光探针1[33]。1能够对各种哺乳动物细胞线粒体中H2O2的水平变化进行成像，以及监测到帕金森氏病的氧化应激模型引起的H2O2水平升高。

Wong等人设计并合成了一种基于咔唑荧光团和TPP的新型双光子(two-photo，TP)荧光“开启”探针2[34]，用于线粒体H2O2检测。它不仅表现出在15分钟内的快速响应和1.96 nM的低检测限(limitof detection，LOD)，而且还具有比其他ROS更高的选择性。共定位实验表明，2在HeLa细胞中选择性定位于线粒体，Pearson共定位系数为0.925。2可以检测深度为105 mm的细胞和组织中的H2O2，具有出色的成像能力。

图2 基于三苯基磷的线粒体定位H2O2探针

在2019年，基于分子内电荷转移(intramolecular charge transfer，ICT)的荧光探针3被报道[35]，用于检测线粒体H2O2，其荧光强度变化为120倍，斯托克斯位移(93 nm)。细胞实验证明探针3具有极好的线粒体靶向和检测内源性H2O2的能力，还可以监测(m-chlorophenylhydrazone，CCCP)在线粒体定向凋亡过程中H2O2水平的变化。

TPP的毒性是生物学应用关注的问题，因此，相继开发并应用了其他具有氮正离子或氧鎓离子的靶向部分。Shao和他的同事提出了一种新颖的“打开”荧光探针4[36]，该探针引入了咔唑基团作为荧光团，对-频哪醇硼苄基部分作为对H2O2的识别位点以及具有氮正离子的季铵化的喹啉单元，既是线粒体靶向载体，又是水溶性基团。探针4表现出良好的水溶性，合适的灵敏度(LOD=40 nM)，高选择性和在5分钟内对H2O2的快速响应。探针4在细胞成像中具有线粒体靶向，可以成功地监测HeLa细胞中外源性和内源性H2O2的水平变化。

Lin课题组开发了一种新颖的“关闭”荧光探针5[37]，该探针具有较大的斯托克斯位移(170 nm)。它实现了对H2O2的高度选择性检测。探针5显示出优异的线粒体靶向特性，并且可以在活的RAW 264.7细胞中感知外源性和内源性H2O2。

Zhang等人构建了一种新型的线粒体靶向比例型荧光探针6[38]，该探针由香豆素作为荧光团和硼酸酯部分作为反应位点组成。当加入H2O2时，化合物6的发射比率(I535 / I640)表现出良好的线性。化合物6显示出合适的灵敏度(LOD = 10 nM)，高选择性。此外，该探针具有良好的线粒体靶向能力，可通过比例荧光成像用于监测NRK细胞中的H2O2。

2018年，Song课题组利用ICT和激发态分子内质子转移(Excited-State Intramolecular Proton Transfer，ESIPT)机制的结合，设计并合成了一种用于H2O2的新型比例荧光探针7[39]。加入H2O2后，探针7表现出显著的比例荧光变化(I594nm/ I666nm)，并且显示出较大的斯托克斯位移变化(152nm)。此外，该探针显示出优异的线粒体靶向特性(Pearson共定位系数= 0.94)，并且可以检测活HeLa细胞中的外源性和内源性H2O2。

Tang等人在2018年开发了一种基于ESIPT机理的线粒体靶向的近红外(near-infrared，NIR)发射荧光探针8[40]，用于比例检测H2O2。该探针具有大的斯托克斯位移(357 nm)，对H2O2具有高选择性和敏感性。在没有H2O2的情况下，该探针在539 nm处显示出弱发射带。加入H2O2会导致539 nm处的发射消失，而新的发射带以669 nm为中心增加。探针8的强度比(F669 / F539)与H2O2的浓度表现出良好的线性相关性(R2=0.9941)。探针8是线粒体靶向的，已应用于活A549细胞中外源性和内源性H2O2的成像。

在2020年，Huang及其同事提出了一种新型的比例荧光探针9，该探针可选择性检测活细胞中的线粒体H2O2[41]。将硼酸芳基酯直接与荧光团通过简单的合成结合，即可构建探针9。ICT机制被芳基硼酸酯与荧光团直接偶联所抑制。在加入H2O2之前，在395 nm激发时，9的发射波长为493 nm。然而，在H2O2存在下，9在493 nm处的荧光发射红移到562 nm，从而实现了比率检测。9对H2O2表现出高度的选择性和敏感性(LOD =0.33μM)，并且可以通过共聚焦显微镜对CHO-K1细胞中的线粒体H2O2进行双通道荧光成像。

Zhou小组构建了一个双光子(two-photo,TP)NIR荧光探针(10)，可通过TP可视化细胞和组织中的线粒体H2O2[42]。10使用苯硼酸作为H2O2反应部分，并使用氧鎓离子作为线粒体靶向单元。该探针可以高选择性检测H2O2，并且在665 nm处荧光强度增强105倍。10在TP激发(800 nm)下的活细胞线粒体H2O2和小鼠肝脏组织(深度50～170μm)进行成像。

H2O2是最重要的ROS之一，在碱性环境中对蛋白质，DNA，RNA和酶等生物分子具有更强的攻击活性，并导致一系列疾病。 Lin组报告了第一个基于硼酸的比率型NIR荧光探针11，用于在碱性条件下检测H2O2和在体内对H2O2成像[43]。11在碱性缓冲液中具有比例荧光成像性能(I720nm / I660nm)和对H2O2的高选择性。细胞实验表明，11可以成功地成像HeLa细胞中的外源H2O2，并且可以对PMA刺激的巨噬细胞或EGF刺激的A431细胞中内源性生成的H2O2成像。在体内成像实验中，11可以对活体动物中的H2O2进行成像。

图3 基于氮正离子或氧鎓离子的线粒体定位H2O2探针

越来越多的证据表明H2O2与细胞凋亡密切相关，尤其是在线粒体中。然而，在凋亡过程中，很少探索不同隔室中H2O2水平的协同变化，尤其是在两个重要的细胞器：线粒体和内质网(Cendoplasmic reticulum,ER)。为了解决这个问题，Tang研究小组开发了两种新型的细胞器特异性荧光探针，分别为12(图3)和13(图4)，可以分别检测线粒体和ER中的H2O2[44]。12和13可以成功地对细胞凋亡过程中线粒体和ER中的内源性或内源性H2O2成像。通过12和13的双重成像，线粒体H2O2的水平首先持续增加，而线粒体定向凋亡的ER H2O2的水平延迟上升。然而，在ER导向的细胞凋亡过程中，ER是H2O2过量产生的主要部位，并且在线粒体中发现了H2O2水平的延迟升高。

Lee课题组开发了另一种ER靶向的近红外探针14[45]。探针14(图4)基于苯乙烯基萘二甲酰亚胺硼酸酯作为H2O2识别位点来检测细胞内H2O2。加入H2O2后，探针14的荧光强度在535处降低，并在640 nm处荧光增加。14与H2O2的荧光反应可在10分钟内完成，溶液中的检测极限为0.30μM。此外，还发现在thapsigargin(一种ER应激诱导物)的存在时，探针14优先积累在Hela细胞的ER中，表明内质网中的H2O2水平升高。

图4 内质网靶向的H2O2探针

由于过氧化脂质在脑细胞溶酶体中的积累可导致阿尔茨海默氏病，通过与溶酶体亚铁的主要相互作用，过氧化氢的内源性或外源性异常产生可能导致细胞损伤[46]。因此，有效监测和检测溶酶体中的过氧化氢对生理学和细胞凋亡具有重要意义，因此一系列溶酶体靶向荧光探针被报道(图5)。Lin等人开发了靶向溶酶体且快速响应(60s)的H2O2荧光探针15[47]，其荧光增强了80倍。该探针具有较高的溶酶体共定位系数(0.96)同时可以对活细胞中外源性和内源性H2O2进行成像，并通过TP显微镜可以观察到深度组织中H2O2的水平。

溶酶体是结合在膜上的酸性囊泡(pH 4～6)，因此，酸性pH可激活的荧光探针可以更好地检测和可视化溶酶体中的H2O2，而不会受其他可能的荧光信号干扰[48-51]。2016年，Zhao等人开发了一种pH触发的H2O2响应的荧光探针16[52]，该探针可以在溶酶体pH下对细胞内H2O2进行响应。荧光探针由硼酸酯部分作为H2O2响应基团和螺苯并吡喃荧光团作为pH可转换位点组成。对于细胞内H2O2检测，只能明显地检测到来自溶酶体区室的荧光发射，而其他区域的荧光发射则是不可见的，这是由于探针的特定pH触发特性引起的。

在2017年，Zhao和他的同事还开发了另外一个溶酶体定位和酸性pH可触发的荧光探针17，用于检测和可视化溶酶体中的H2O2[53]。该探针由H2O2响应基团硼酸酯单元，pH值可激活的苯丙氨酸荧光团和溶酶体定位的吗啉基团组成。值得注意的是，该探针无需外部刺激即可对HeLa细胞中内源性溶酶体H2O2进行荧光监测，而来自其他细胞内细胞器的信号干扰则可以忽略不计。

图5 溶酶体靶向的H2O2探针

高尔基体的氧化应激与大量ROS的产生和高血压的进展显着相关。值得注意的是，H2O2，作为氧化应激的指标，对其进行定量检测对于揭示高尔基氧化应激的机制至关重要。Tang和他的同事开发了一种TP荧光探针18[54](图6)，基于靶向高尔基体的新型苯磺酰胺基团在活细胞和肾脏组织中可以对H2O2比例成像。值得注意的是，与不存在H2O2时相比，存在H2O2时F560nm/F470nm的比率增加了130倍。18成功检测到高血压小鼠肾脏中H2O2的水平增加。这项工作为揭示高尔基体氧化应激与高血压之间的关系以及将来治疗高血压的新药物靶标提供了理想的工具。

图6 高尔基体靶向的H2O2探针

细胞核不仅是活细胞中最关键的细胞器，而且还包含绝大多数的DNA[55]。异常的ROS可以攻击细胞核中的DNA，并诱导DNA碱基的氧化修饰，这与衰老，阿尔茨海默氏病和癌症有关[56-58]。因此，ROS的核定位探针非常重要(图7)。2014年，Yi等人构建了一种新型的核定位的比率型H2O2荧光探针19，该探针将NP1连接到核定位信号(nuclear localization signal，NLS)肽(VQRKRQKLMP-NH2)上[59]。 NLS肽已经被用作有效的核传递载体。探针19可用作HeLa细胞中核H2O2的比例检测。

在2019年，Yin及其同事开发了一种新的H2O2细胞核可视化探针20，该探针由H2O2荧光传感器(NP1)和扩展的NLS肽(pep6，CGGGGGVQRKRQKLMP)组成[60]。重要的是，由NP1和pep6组成的探针系统用于对HepG2细胞中刺激后的细胞核H2O2水平进行成像。这种设计策略可能成为开发核定位荧光探针的未来设计方法。

图7 ROS的核定位探针

3 总结与展望

我们总结了线粒体、内质网、溶酶体以及细胞核靶向的基于硼酸盐识别的H2O2荧光探针，同时讨论了它们的靶向策略、荧光行为及其在生物成像中的应用。总之，基于硼酸盐的H2O2局部检测的探针已经取得了很大的进步。但是，靶向细胞器的H2O2荧光探针也有很大的优化空间：(1)大多数报道的基于硼酸盐的靶向细胞器的H2O2荧光探针的发射波长通常分布在可见光区域，进一步开发具有近红外发射的靶向细胞器的H2O2荧光探针，这样更有助于生物学研究中的应用。(2)由于探针进入特定细胞器所引起的生理状态变化可能会导致这些探针从细胞器中逸出。因此，能够结合特定细胞结构(包括但不限于蛋白质、脂质体和DNA)的荧光探针的开发将提供准确的定位和更精细的研究。我们深信，这些H2O2荧光探针将成为化学家、生物学家和医学科学家进行疾病诊断和病理生理机制研究的强大工具。