miR-9、miR-192和miR-205在宫颈癌诊断中的价值

李 艳，张 锦，闫丽明

(延安大学附属医院妇科，陕西 延安 716000)

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，也是导致女性死亡的第四大癌症，每年在中国约有27.5万人死于宫颈癌[1]。宫颈癌发病率高于其他妇科肿瘤类疾病，每年约有100万新发病例[2]。目前宫颈癌患者的治疗策略主要依据国际妇产科联合会(FIGO)的标准进行组织学分级和手术病理分期、肿瘤分级，不足以反映宫颈癌在疾病中的异质性。虽然已经有很多识别宫颈癌新的诊断和预后的生物标志物可以改善治疗的效果，但临床晚期的患者仍然面临着高死亡率和预后不良的现象。因此，还要寻找更可靠的临床病理和分子预后标志物，来完善个性化治疗策略。评估肿瘤的迁移、患者的预后和复发是非常重要的，微小RNA(miRNA)是一种进化上十分保守的核苷酸的小分子，基因表达的负调控因子，参与细胞的生长、分化、发育和死亡等所有生物过程。近年来发现，miRNA的异常表达是癌症的主要标志之一。 miR-9、miR-192和miR-205异常表达，在卵巢癌、直肠癌等肿瘤的发生和进展中起着主要作用。但目前miR-9，miR-192和miR-205在宫颈癌生物学作用研究较少，因此，本研究通过比较宫颈癌患者与健康者血清miR-9、miR-192和miR-205水平，分析宫颈癌患者血清miR-9、miR-192和miR-205水平与临床病理的关系，探讨miR-9、miR-192和miR-205诊断宫颈癌的临床价值，为宫颈癌的下一步有效治疗提供依据。

1 对象和方法

1.1 研究对象

选取2018年5月至2019年7月在延安大学附属医院接受治疗的宫颈癌患者78例为观察组，选取同期在本院体检健康者30例为对照组，年龄29～46岁。观察组纳入标准:1)HPV感染检测HPV16/18确诊为阳性；2)经病理诊断为宫颈癌患者；3)入医前未经过放疗或者化疗治疗的患者；4)病理资料完整；5)没有妇科内分泌疾病和其他妇科肿瘤疾病的患者。排除标准:1)年龄大于70岁的患者；2)合并其他恶性肿瘤和心肺等脏器功能不全的患者；3)存在免疫功能障碍的患者；4)合并其他慢性感染性疾病的患者。

1.2 检测方法

1.2.1 主要试剂和仪器

Trizol试剂盒购自于invitrogen公司，M-MLV反转录试剂盒购自于上海生工生物工程有限公司，台式离心机购自于Beckman公司产品，定量PCR仪购自于美国ABI公司。

1.2.2 标准采集与处理

采集标本1 h后用Ficoll提取液提取6 mL血清，再放入1 mL的Trizol的裂解液裂解细胞。

1.2.3 血清中的Total RNA的提取

血清和Trizol液体各2 mL放入离心管中，充分混匀振荡，进行裂解后提取Total RNA，在加入Rnasin后放于-80 ℃的冰箱中保存。

1.2.4 RT-qPCR反应检测

使用M-MLV反转录试剂盒合成cDNA，反应体系为20 μL,茎环引物为2 μL,Total RNA为2 μL，然后加入ddH2O到20 μL，混匀，放到扩增仪上，15 ℃ 15 min,40 ℃ 20 min,80 ℃ 15 min反应，合成cDNA放于-80 ℃的冰箱中保存。在使用MGB探针，以U6作为内参，反应体系为10 μL,实验重复3次，正向引物序列为2 μL，反向引物序列2 μL，MGB探针2 μL，cDNA为2 μL，在加入ddH2O到30 μL，PCR反应条件:90 ℃ 2 min,80 ℃ 20 s,45 ℃ 15 s,共计45个循环。以U6作为内参，对miR-9，miR-192和miR-205进行归一化处理，采用相对定量法，表达倍数的变化用F=2-△△Ct公式计算。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 miR-9、miR-192和miR-205在宫颈癌中的表达

观察组血清miR-9、miR-205水平显著高于对照组，miR-192水平显著低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组血清miR-9、miR-192和miR-205水平比较

2.2 宫颈癌患者血清miR-9、miR-192和miR-205水平与临床病理的关系

miR-9、miR-192和miR-205与肿瘤的TNM分期、分化程度具有相关性(P<0.05)，miR-9、miR-205与肿瘤的组织类型具有相关性(P<0.05)，miR-9、miR-192与肿瘤的淋巴结远处转移具有相关性(P<0.05)。见表2。

表2 宫颈癌患者血清miR-9、miR-192和miR-205水平与临床病理的关系

2.3 miR-9、miR-192和miR-205表达的ROC曲线分析

ROC曲线分析结果显示，miR-9、miR-192和miR-205诊断宫颈癌的AUC值分别为0.829(SE为0.082，95%CI为0.652～0.969)、0.784(SE为0.085，95%CI为0.627～0.949)和0.712(SE为0.092，95%CI为0.547～0.922)。miR-9、 miR-192和miR-205检测宫颈癌的敏感度分别为80.93%、78.23%和69.82%，特异度分别为77.03%、79.35%和81.14%。见图1。

3 讨论

宫颈癌是一种常见的女性癌症，每年都会有26万人死于该疾病。基于该组织或者血清中分子水平的预后标志物的开发，有助于个体化的治疗和病情的改善，有助于延长患者的生存时间甚至达到治愈的效果。最近研究[3]发现miR-9、miR-192和miR-205在许多肿瘤组织和细胞中均表达异常，miR-9在喉鳞癌组织、卵巢癌等组织中表达会升高，miR-192结直肠癌组织、卵巢癌等组织中异常低表达，miR-205在子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌等肿瘤中出现异常高表达，这就意味着miR-9、miR-192和miR-205异常表达和各种癌症的发生和发展有着高度的相关性。

miRNA是在进化中的单链非编码RNA，是通过靶基因蛋白调节的表达调控生物体的生长、发育和凋亡。目前已经发现650多个miRNA与人类疾病的发生和发展有着密切的关系，在不同的肿瘤中表达有些类似，有些miRNA可以促进肿瘤的发展，有些miRNA可以抑制肿瘤的发生。本文研究结果表明，宫颈癌患者的miR-9和miR-205水平显著高于健康者，宫颈癌患者的miR-192水平显著低于健康者，这就意味着miR-9和miR-205在宫颈癌中异常高表达，miR-192在宫颈癌中异常低表达。PARK等[4]研究发现，miR-9在人类的多种癌症中都出现异常表达；也有研究[5]证明，miR-9促进宫颈癌细胞的迁移和增殖，对下游基因的表达具有调控作用；李小燕等[6]研究证明miR-9通过调控不同的靶向基因mRNA对神经细胞的增殖、迁移具有重要的作用。目前，miR-205在宫颈癌中相关报道较少，仍有许多问题尚需要探讨，LU等[7]发现，miR-205具有调控宫颈癌细胞增殖的能力，对细胞周期也有一定的影响，也有相关研究[8]报道，在HPV为阳性的宫颈癌中，miR-205的表达较正常组织明显上升，YU 等[9]研究表明，在宫颈癌细胞分离过程中miR-205 的含量表达比较丰富，在HPV18+Hela细胞外，宫颈癌组织中miR-205表达有所增长。宋伟国等[10]研究发现miR-192在胃癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌等多种癌症中表达水平呈现下调趋势。也有相关文献[11]报道miR-192在结肠癌组织中明显下调，因此说明miR-192和癌症的发生和发展关系也比较密切。

上述研究只说明miR-9、miR-192和miR-205在癌症中的表达，并未说明在癌中的发生和发展的相关性，本研究对宫颈癌患者miR-9、miR-192和miR-205水平与临床病理的关系进行分析，结果显示，miR-9、miR-192和miR-205与年龄、肿瘤大小没有相关性,miR-192与组织学上划分没有相关性,miR-205和淋巴结转移情况无相关性；miR-9、miR-192和miR-205与TNM分期和肿瘤的分化的程度具有相关性，miR-9、miR-205与组织学上划分具有相关性，miR-9、miR-192与淋巴结转移情况具有相关性。ROC曲线分析结果显示，miR-9、 miR-192和miR-205检测宫颈癌的敏感度分别为80.93%、78.23%和69.82%，特异度分别为77.03%、79.35%和81.14%。上述结果证明，miR-9、miR-192和miR-205与癌症的发生和发展具有相关性。

XIN等[12]研究证明miR-9甲基化能够促进癌症的发生和发展以及肿瘤的转移和复发，能够促进子宫癌细胞的增殖和迁移，但在卵巢癌和胃癌中能够抑制癌细胞的生长，表明miR-9即是促癌因子，又是抑制癌症发展的因子[13]。本研究结果显示miR-9是促癌因子，和癌症的分期、肿瘤的分化和淋巴的转移程度具有一定的相关性。董立新等[14]报道，miR-192能够调节细胞生长、周期和凋亡的作用，可用来辅助临床肿瘤分期、转移和预后等诊断，miR-192的下调与乳腺癌、肾癌、肝癌等发生关系密切；在食管癌中可抑制细胞的凋亡，促进细胞的增殖作用；miR-192在不同肿瘤的发展中作用不同。miR-205在妇科疾病中研究比较广泛，一般集中在子宫内膜癌的领域，在宫颈癌和卵巢癌中的相关报道较少，LI等[15]研究表明，miR-205子宫内膜癌中高表达；也有研究[16]报道，miR-205在卵巢内膜样癌组织中表达明显较正常者增多，和卵巢癌的发生具有一定的相关性；SONG 等[17]报道，miR-205水平与乳腺癌的临床病理学参数关系密切，可作为独立的预后因子，对乳腺癌预测价值较高，与本文研究结果具有相似性。

综合上述，宫颈癌患者中miR-9和miR-205呈现高表达，miR-192呈现低表达，和宫颈癌的临床病理学关系密切，对宫颈癌的诊断具有一定的参考价值，但由于本文研究样本量有限，是否作为临床诊断的独立预后因子，还有待于进一步研究。