基于Notch信号筛选调控心肌纤维化的miRNA

李云云，周学亮

(南昌大学第一附属医院心脏外科，南昌 330006)

心肌梗死(myocardial infarction,MI)会导致心肌细胞永久性丧失，瘢痕组织形成，从而导致心力衰竭发生，是全世界死亡和残疾的主要原因之一[1-2]。心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)主要是通过转化为活化的肌成纤维细胞(cardiac fibroblast-myofibroblast transformation,CMT)参与心肌纤维化，表现为波形蛋白(Vimentin)表达的降低、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达的升高，在MI后重塑中起关键作用[3-4]。

Notch信号通路由Notch受体和配体等构成，两者结合后，Notch发生二次裂解，释放胞内结构域(notch intracellular domain,NICD)进入细胞核，与转录因子RBP-Jκ(recombination signal binding protein for immunoglobulin Jκ)结合，启动Hes、HRT等靶基因转录，可抑制α-SMA的表达，从而抑制CMT的发展，间接抑制MI后的心脏纤维化[3,5]。WANG等[6-9]研究发现，在心肌纤维化的发生发展中，miRNA发挥了至关重要的作用：miR-155可以抑制MI后的CFs增殖，miR-29b的过表达可以显著减少MI后的瘢痕形成，促进MI后心功能恢复等；miR-29b抑制MI后心肌纤维化，是通过Notch信号通路介导的；同样，miR-199b-5p促进MI后心肌纤维化，也是通过影响Notch信号通路等介导的。这些都提示，部分miRNA可能通过Notch信号通路，调节MI后的心肌纤维化。因此，本研究将基于Notch信号通路筛选特异性调控心肌纤维化的miRNA，为逆转心肌纤维化提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料

TGF-β1购自Sigma(美国)，DAPT购自Selleck(中国)，miRNA抑制剂、miRNA引物购自Ribobio(中国)，Dulbecco改良Eagle培养基购自GE Biotechnology(美国)，胰蛋白酶-EDTA溶液、FBS、Trizol、逆转录酶、SYBR Premix购自Thermo Fisher(美国)，Oligo-dT引物购自上海捷瑞生物工程有限公司(中国)，CCK-8 Assay购自Dojindo(日本)，miRNAs快速检测试剂盒购自汉恒生物(中国)。

1.2 实验方法

1.2.1 原代大鼠CFs分离培养

无菌条件下取新生SD大鼠(出生1～3 d)心脏，0.05%胰蛋白酶分离原代大鼠CFs，采用差速贴壁法提取CFs。将CFs放入10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中，置于5% CO2、37 ℃的加湿培养箱中培养。待CFs生长近融合状态时以1:2传代。本研究中用第2—3代CFs。

1.2.2 CMT诱导

按“1.2.1”方法分离培养CFs，细胞生长至70%融合度时，无血清培养基饥饿12 h，使用10 ng·mL-1转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)无血清培养基培养48 h。

1.2.3 Notch信号通路抑制

按“1.2.1”方法分离培养CFs，细胞生长至70%融合度时，无血清培养基饥饿12 h，使用10 ng·mL-1TGF-β1+10 μmol·L-1γ-分泌酶抑制剂(γ-secretase inhibitor，DAPT)无血清培养基培养48 h。

1.2.4 筛选miRNA

按“1.2.1”方法分离培养CFs，细胞生长至70%融合度时，无血清培养基饥饿12 h后，将CFs被分为3组：无血清培养基培养48 h(sham组)、含10 ng·mL-1TGF-β1的无血清培养基培养48 h(TGF组)；含10 ng·mL-1TGF-β1+10 μmol·L-1DAPT的无血清培养基培养48 h(TGF+DAPT组)。通过miRNAs快速检测试剂盒(MirQEasy)检测miRNA的表达，以U6基因表达量作为内参，筛选差异表达的miRNA。

1.2.5 miRNA表达抑制

设计miR-21、miR-23、miR-140反向序列抑制剂，按“1.2.1”方法分离培养CFs，细胞生长至70%融合度时，在含100 pmol·L-1miRNAs抑制剂的无血清培养基培养12 h，加入10 ng·mL-1TGF-β1培养相应时间。

1.2.6 细胞增殖测定

按“1.2.1”方法分离培养CFs，细胞生长至70%融合度时，在96孔培养板中，将CFs以2×103个·孔-1的密度接种(含10%胎牛血清培养基)，并在37 ℃的加湿培养箱中培养。于培养0、24、48、72、96 h后按说明书采用CCK-8 Assay检测CFs活细胞：将CCK-8溶液加入到96孔板中的细胞中，并将板在37 ℃下孵育4 h，并使用酶标仪在450 nm下读取每个孔的光密度。

1.2.7 实时荧光定量PCR检测

使用Trizol从CFs中提取总RNA。使用Thermo NanoDrop 2000测定RNA浓度和纯度。使用1 μg总RNA、逆转录酶和Oligo-dT引物合成cDNA。使用SYBR Premix和以下引物进行实时荧光定量PCR检测：Vimentin引物序列5′ATATATGAGTCCCTGGAGCG 3′和5′AGGTGGCGATCTCAATGTCA 3′，α-SMA引物序列5′GCTATTCAGGCTGTGCTGTC 3′和5′GGTAGTCGGTGAGATCTCGG 3′，GAPDH引物序列5′AGTCTACTGGCGTCTTCACC 3′和5′CCACGATGCCAAAGTTGTCA 3′，U6引物序列5′CGCTTCGGCACATATACTA 3′和5′CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA 3′。PCR在Applied Biosystems 7900 QPCR系统上进行，循环参数：95 ℃ 5 min，1个循环;95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，40个循环。

1.3 统计学方法

所有数据均以均数±标准差表示，并用SPSS 11.0统计软件分析。单因素方差分析对照组和处理组之间的差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 调控心肌纤维化的Notch信号相关miRNA

为了筛选相关miRNA，本研究首先以TGF-β1诱导大鼠CFs发生CMT，期间利用DAPT抑制Notch信号通路。结果显示，TGF-β1诱导前后，有16个miRNA表达明显上调：miR-21(RQ=8.32，P<0.000 1)、miR-23b(RQ=2.73，P<0.000 1)、miR-140(RQ=1.60，P<0.05)、miR-27b(RQ=4.52，P<0.001)、miR-99b(RQ=3.95，P<0.001)、miR-103(RQ=3.50，P<0.01)、miR-199-3p(RQ=4.92，P<0.000 1)、miR-223(RQ=6.04，P<0.000 1)、miR-224(RQ=7.80，P<0.000 1)、miR-532-5p(RQ=4.27，P<0.01)、rno-miR-224(RQ=3.22，P<0.000 1)、miR-450(RQ=5.30，P<0.000 1)、miR-155(RQ=2.43，P<0.05)、miR-314(RQ=3.96，P<0.000 1)、miR-652(RQ=4.80，P<0.000 1)、miR-31(RQ=5.60，P<0.000 1)。在TGF-β1诱导基础上加入DAPT后，发现15个miRNA表达差异明显，其中上调2个：miR-31(RQ=1.64，P<0.01)、miR-314(RQ=2.27，P<0.000 1)；下调13个：miR-21(RQ=0.21，P<0.000 1)、miR-23b(RQ=0.38，P<0.000 1)、miR-27b(RQ=0.28，P<0.001)、miR-99b(RQ=0.31，P<0.000 1)、miR-103(RQ=0.33，P<0.001)、miR-199-3p(RQ=0.40，P<0.000 1)、miR-223(RQ=0.23，P<0.000 1)、miR-224(RQ=0.29，P<0.000 1)，miR-497(RQ=0.67，P<0.05)，miR-532-5p(RQ=0.28，P<0.01)、rno-mir-224(RQ=0.42，P<0.000 1)、miR-450(RQ=0.27，P<0.000 1)、miR-652(RQ=0.38，P<0.000 1)。见图1。结果表明，基于Notch信号通路，miR-31、miR-314、miR-21、miR-23b、miR-27b、miR-99b、miR-103、miR-199-3p、miR-223、miR-224,miR-532-5p、rno-mir-224、miR-450、miR-652可能调控心肌纤维化。

2.2 miR-21、miR-23b促进大鼠CFs增殖和CMT发展

miR-21、miR-23b、miR-140抑制剂加入大鼠CFs，CCK-8检测结果显示，miR-21、miR-23b抑制剂可明显抑制CFs的增殖(均P<0.05)，而miR-140抑制剂对CFs增殖无明显影响(P>0.05)(图2A)。PCR检测结果显示，miR-21、miR-23b抑制剂可明显提高Vimentin表达(RQ=2.52、1.86，均P<0.001)，降低α-SMA表达(RQ=0.50、0.74，均P<0.001)，而miR-140抑制剂对Vimentin、α-SMA表达无明显影响(RQ=1.00、1.11，均P>0.05)(图2B)。表明miR-21、miR-23b促进CFs增殖和CMT发展。

3 讨论

MI后过度纤维化极易诱发包括心力衰竭在内的严重心脏病[10]。而CMT是心肌纤维化的始发事件。最新研究[5]表明，Notch信号通路抑制CMT，限制心肌纤维化发展。因此，基于Notch信号通路，筛选调控心肌纤维化的关键分子对相关心脏病的预防与治疗有着重要的意义。

而BAYOUMI等[11-13]研究发现，在心肌纤维化的发生发展中，大量miRNA扮演着重要的角色，其中，miR-29b、miR-199b-5p调控心肌纤维化的发展是通过Notch信号通路介导的[8-9]，提示部分miRNA可能是基于Notch信号通路调控心肌纤维化的关键分子。因此，本研究旨在基于Notch信号通路，筛选特异性调控心肌纤维化的miRNA。首先通过抑制Notch信号通路，找出调控心肌纤维化的可能miRNA，其次，在这些miRNA中，去证明miR-21、miR-23b促进心肌纤维化的发展。

在本研究中，鉴于TGF-β1在心肌纤维化中的关键作用，首先利用TGF-β1，筛选出16个可能调控心肌纤维化的miRNA；其次，利用DAPT抑制Notch信号通路，筛选出了基于Notch信号通路，14个可能调控心肌纤维化的miRNA，其中上调2个，下调12个。之后，笔者想验证基于Notch信号通路，部分可能调控心肌纤维化的miRNA是否特异性调控心肌纤维化，因此，笔者结合查阅的文献[14-16]，进行了miR-21、miR-23b、miR-140在CFs增殖和CMT中的作用研究。结果表明，miR-21、miR-23b抑制剂可明显抑制CFs增殖，且提高CFs标志物Vimentin表达，降低肌成纤维细胞标志物α-SMA表达。换句话说，miR-21、miR-23b促进大鼠CFs增殖和CMT发展。总之，基于Notch信号通路，本研究筛选出了特异性调控心肌纤维化的miR-21、miR-23b。

尽管有大量的研究[17-19]证明，miRNA可以作用于Notch信号通路，但大部分都是介导心肌保护与损伤的研究，如miR-363通过Notch信号传导，调节缺氧诱导的心肌细胞凋亡；miR-208a通过Notch/NF-κB信号通路，调节缺血再灌注中的心肌细胞损伤；miR-449a调节缺氧/复氧性细胞损伤是通过Notch1信号通路介导的。然而，却很少有miRNA通过Notch信号通路调节心肌纤维化的研究。因此，本研究基于Notch信号通路，筛选出了特异性调控心肌纤维化的miR-21、miR-23b。这为进一步研究miRNA与Notch信号通路在调控心肌纤维化中的关系奠定了基础，并为基于miRNA调控，开发逆转心肌纤维化的药物提供了基础信息。然而，miR-21、miR-23b调控心肌纤维化的具体机制有待进一步研究发现。