雁北嗜蓝孢孔菌菌株液体培养条件优化

郭霄飞 李艳婷 郭 尚* 宋敏丽 白 倩 徐莉娜 南晓洁 张 程

雁北嗜蓝孢孔菌菌株液体培养条件优化

郭霄飞1李艳婷1郭 尚1*宋敏丽2白 倩3徐莉娜1南晓洁1张 程1

（1. 山西省农业科学院食用菌研究所，山西 太原 030031；2. 太原师范学院生物系，山西 晋中 030619；3. 北京理工大学生命学院，北京 100081）

以菌丝体生物量、菌丝生长速度和菌丝体胞外多糖含量为指标，对3个雁北嗜蓝孢孔菌菌株液体发酵培养的碳源、氮源和无机盐进行优化筛选，以为该菌的大规模培养和人工驯化提供依据。结果显示，海藻糖是1号和2号菌株的最佳碳源，葡萄糖是3号菌株的最佳碳源；3个菌株的最佳氮源均为豆粕粉；最佳无机盐1号菌株是硫酸镁，2号、3号菌株是磷酸二氢钾。

雁北嗜蓝孢孔菌；液体发酵；碳源；氮源；无机盐

雁北嗜蓝孢孔菌（S. Guo&L. Zhou）属于担子菌门、伞菌纲、锈革孔菌目、锈革孔菌科（Hymenochaetaceae）、嗜蓝孢孔菌属（），是由郭尚工作室从山西大同地区的沙棘腐木上首次采集得到[1]。该地属于温带大陆性季风气候，树木很多，土壤为碱性，有大量的沙棘树、杨树林和松树林[2-5]，当地人将其作为一种治疗感冒、提升免疫力的特效药而经年使用。雁北嗜蓝孢孔菌子实体除蛋白、粗多糖、氨基酸等含量较高外，还富含三萜类、多酚、黄酮以及甾醇类等多种益于人体健康的功能性成分[6]。

雁北嗜蓝孢孔菌的生长周期较长[3]，目前已初步明确其生长条件[12-15]，但尚无法进行高产培养，以利用其价值。我们分别从山西大同地区的山坡上、水沟边和平地的沙棘木上分离得到3个雁北嗜蓝孢孔菌菌株，采用液体发酵培养方式，以菌丝体生物量、胞外多糖含量、菌丝生长速度作为测定指标，对其营养源进行单因素实验研究，以探索该菌的最佳发酵配方，为后续利用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

（1）供试菌株。3个雁北嗜蓝孢孔菌菌株，分别编号为1、2和3，由山西省农业科学院食用菌研究所保藏。子实体形态见图1。

图1 雁北嗜蓝孢孔菌子实体形态

（2）试剂。海藻糖、可溶性淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、豆粕粉、蛋白胨、尿素、硫酸铵、玉米浆、磷酸二氢钾、硫酸镁、磷酸氢二钾、碳酸钠、氯化钠、维生素B1、维生素B2、无水乙醇、浓硫酸、苯酚等。

（3）仪器与设备。SM830立式压力蒸汽灭菌锅、MS104TS电子分析天平、CRY100B恒温摇床、BPG-9106A电热鼓风干燥箱、QXZ-1000A光照恒温培养箱、SW-CJ-2D超净工作台、C21-SDHCB9E88电磁炉、TU-1810PC紫外可见光度计、FC-5706离心机、DZKW-0-2电热恒温水浴锅等。

1.2 培养基配方单因素试验

（1）加富PDA培养基。马铃薯200 g、磷酸二氢钾1 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、维生素B110 mg、水1 L。

（2）液体培养基配方。试验设培养基基础配方：葡萄糖20 g、蛋白胨35 g、磷酸二氢钾0.5 g、硫酸镁0.25 g、维生素B1100 μg、维生素B2500 μg、水1 L。

①碳源试验设5种碳源，分别为葡萄糖、蔗糖、海藻糖、可溶性淀粉和乳糖。葡萄糖配方为基础配方，分别将相同重量的其余碳源替换基础配方中的葡萄糖即为其余碳源的对应配方。

②氮源试验设5种氮源，分别为蛋白胨、豆粕、尿素、硫酸铵和玉米浆。蛋白胨配方为基础配方，分别将相同重量的其他氮源替换基础配方中的蛋白胨即为其余氮源的对应配方。

③无机盐试验设5种无机盐，分别为磷酸二氢钾、硫酸镁、磷酸氢二钾、碳酸钠和氯化钠。磷酸二氢钾配方为基础配方，分别将相同重量的其他4种无机盐替换基础配方中的磷酸二氢钾即为其余无机盐的对应配方。

称量药品制备液体培养基溶液置于三角锥形瓶中，于115 ℃下灭菌30 min。将3个菌株分别接种到无菌培养皿中，待菌丝长满后用打孔器在超净台取菌丝接种到装有不同配方液体发酵液的150 mL培养瓶中，每个菌株各配方设置3个重复。置于25 ℃、转速150 r/min的恒温摇床中培养14天后，进行数据测量，探索雁北嗜蓝孢孔菌液体发酵的最佳碳、氮源和无机盐。

1.3 指标鉴定方法

（1）菌丝体生物量测定。将培养14天后的雁北嗜蓝孢孔菌发酵液用玻璃棒混匀，在滤纸上过滤后，于60 ℃干燥箱中烘干后取出测量菌球生物量并记录[16]。

（2）菌丝生长速度测定。从发酵液中随机挑取肉眼可见的3个菌球，放在无菌平板上培养3天后，取出观察菌丝生长状况，用尺子测量菌落直径，取平均值计算菌丝的日生长速度[7]。

（3）胞外多糖含量测定。采用苯酚-硫酸法。

①配制多糖溶液：将菌球烘干，在研钵内研磨成粉，按料液比为1/50溶解在锥形瓶中，浸泡30 min，置于80 ℃水浴锅中提取2 h，用玻璃棒不时搅拌。取出自然冷却至室温，3 000 r/min离心2次，向离心后溶液中加入4 ℃下预冷的无水乙醇，配制成浓度为80%左右的乙醇液，置于4 ℃冰箱中冷藏，醇沉过夜，使沉淀析出。之后取出离心，取滤液烘干，加5 mL水配成多糖水溶液。

②制备5%的苯酚溶液：在容量瓶中定容，避光保存，现用现配。

③制备标准葡萄糖溶液（0.1 mg/mL）。

④制备标准曲线：分别量取葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6和0.8 mL置于5支试管中，加蒸馏水使溶液至2 mL，再加1 mL 5%的苯酚溶液和5 mL浓硫酸，静置30 min；测吸光度，波长为490 nm，空白对照用蒸馏水。用吸光度作为纵坐标，葡萄糖含量作为横坐标制标准曲线，得到一个回归方程。

⑤样品测定：取1 mL多糖溶液，稀释至2 mL，加入1 mL苯酚和5 mL浓硫酸，静置30 min，测吸光度，波长为490nm，空白对照用蒸馏水。根据吸光度求得多糖含量[8-11]。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

试验得到的葡萄糖标准曲线函数为=20.19+0.080 6，2=0.996（图2）。

图2 葡萄糖标准曲线

2.2 不同菌株对碳源的利用

3个雁北嗜蓝孢孔菌菌株在5种不同碳源液体培养基上的生长情况不一致（表1），其中1号、2号菌株均在以海藻糖为碳源的培养基中菌丝生长速度较快，菌丝生物量和胞外多糖含量也高；其次是可溶性淀粉和葡萄糖，但与海藻糖的差异不显著；而乳糖3项指标均极显著低于其他处理。3号菌株的3项指标则以葡萄糖的较高；海藻糖次之。

表1 3个菌株在不同碳源液体培养基中的发酵状况

注：各菌株同列不同大、小写字母分别表示1%和5%水平差异显著。下同。

2.3 不同菌株对氮源的利用

3个菌株在5种氮源液体培养基中的生长情况不一（表2），但菌丝生长速度、菌丝生物量、胞外多糖含量均以豆粕粉为高。3个菌株在尿素和硫酸铵液体培养基上的生长情况都不佳。

2.4 不同菌株对无机盐的利用

由表3可知，5种无机盐液体培养基配方中，1号菌株在磷酸二氢钾和硫酸镁培养基的生长状态差异不显著，以硫酸镁培养基的3项指标略高。而2号、3号菌株在磷酸二氢钾和硫酸镁培养基的3项指标差异都不显著，以磷酸二氢钾培养基略高。3个菌株在碳酸钠、氯化钠培养基的生长状况均不佳。总的来看，1号菌株的最适无机盐是硫酸镁，2号和3号菌株的最适无机盐是磷酸二氢钾。

3 结论与讨论

本试验从碳源、氮源和无机盐3方面的营养成分，对3个雁北嗜蓝孢孔菌菌株液体发酵的菌球生长状况进行测定，初步找出不同菌株的最适碳源、氮源和无机盐，可为该菌的菌种制备及大规模液体发酵利用等提供依据。

1号、2号菌株筛选出的最适碳源为海藻糖，与刘晓钢等[1]的研究结果一致；3号菌株的最适碳源为葡萄糖。

本试验3个菌株最适氮源都是豆粕粉，与刘晓钢等[1]的研究也一致。

筛选出的最适无机盐，1号菌株为硫酸镁，2号、3号菌株为磷酸二氢钾。筛选出最适合的无机盐为硫酸镁和磷酸二氢钾两种，与赵媛等[7]的研究结果基本一致。

本试验菌株1号和2号采自山坡和水沟边，3号菌株从平地采集。实验结果中不同菌株最适合的碳源和无机盐有差异。且不同菌株在配方中碳源、氮源、无机盐相同的情况下，其生物量、菌丝生长速度和胞外多糖含量不同，这可能与菌株采集地的环境有关，具体环境因素有待进一步探索。

表2 3个菌株在不同氮源液体培养基中的发酵状况

表3 3个菌株在不同无机盐液体培养基中的发酵状况

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Optimization of liquid culture conditions of different strains of

Guo Xiaofei1Li Yanting1Guo Shang1*Song Minli2Bai Qian3Xu Lina1Nan Xiaojie1Zhang Cheng1

(1. Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Institute of Edible Fungi, Taiyuan, Shanxi 030031, China; 2. Department of Biology in Taiyuan Normal University, Jinzhong, Shanxi 030619, China; 3. School of Life Science, Beijing institute of technology, Beijing 100081, China)

The mycelium biomass, mycelial activity and extracellular polysaccharide content were used as indicators to study the liquid culture medium ofcollected from three regions, and the best carbon source, nitrogen source and inorganic salt for liquid culture of different strains were screened. The results showed that trehalose was the best carbon source for strain 1 and 2, glucose was the best carbon source for strains 3; the best nitrogen source for all strains was soybean meal; the best inorganic salt for strains 1 was MgSO4, and the best inorganic salt for strains 2 and 3 was KH2PO4. This study can provide the basis for large-scale culture and artificial domestication of this strain.

; liquid culture; carbon source; nitrogen sources; inorganic salts

S646

B

2095-0934（2020）04-272-05

山西省科技基础条件平台项目（201705D121012），项目名称为山西省食用菌种质资源共享服务平台建设；山西省农业科学院生物育种工程项目（17yzgc115），项目名称为功能性多孔菌优良菌株的筛选；山西省重点研发计划项目（201803D221009-2），项目名称为特色食药用菌功能产品制造关键技术研究与新产品创制

郭霄飞（1985—），男，硕士，助理研究员，主要从事食（药）用菌资源与综合利用的研究。E-mail：527305917@qq.com。

郭尚，E-mail：gs0351@sohu.com。