微生物脂肪酶的性质及应用

王鑫蕊

摘 要： 工业用脂肪酶主要来源于酵母和细菌，最适温度和pH范围多为35～45℃和6.5～8.0，适应中低温和偏中性的应用环境。目前，中低温脂肪酶在工业应用中存在一些普遍问题，如高温或碱性等条件下易失活等，这在一定程度上限制了脂肪酶的工业应用。在此背景下，人们逐渐关注来自于极端微生物的极端脂肪酶资源的挖掘，如嗜热脂肪酶、碱性脂肪酶、低温脂肪酶及综合多极端脂肪酶等，以达到工业应用要求。其中，嗜热脂肪酶多从嗜热菌中分离得到，具有催化效率高、冷却能耗低、改善底物可溶性等优点，且在应用时较中低温酶更稳定。耐碱脂肪酶则多从土壤、盐碱湖的耐碱菌中分离得到，常用于洗涤清洁工业。目前报道的嗜热耐碱脂肪酶多来源于芽孢杆菌，其适宜温度在40～60℃之间，最适pH在7.0～9.0之间。本文主要对微生物脂肪酶的性质及应用做论述。

关键词： 微生物;脂肪酶;性质;应用

【中图分类号】TU74     【文献标识码】A     【文章编号】1674-3733（2020）13-0246-01

引言

生物催化剂因其环保、高效和特异性等特点而广泛应用于各工业领域。脂肪酶是自然界中最具潜力的工业酶之一，能催化水解、酯化、酯交换等反应，在食品营养、油脂化学工业等方面有较好应用。微生物也是酶资源的重要来源，微生物酶的研究从20世纪90年代开始兴起，以蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等产业价值高的酶类作为主要研究对象。微生物的低温酶与耐盐酶等结构和功能新颖的极端酶凭借其独特的催化作用大大拓宽了微生物酶的应用范围，也给酶工程的研究带来了新的思路和方向。

1 实验材料和方法

1.1 实验材料

大肠杆菌Top10和BL21菌株由本实验室保存。引物由上海生工有限公司合成。TaqDNA聚合酶、限制性内切酶和T4DNALigase购于Takara生物技术公司。胰化蛋白胨、酵母提取物等购于Oxoid公司，常用生物试剂卡那霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）购于BIOFROXX。系列底物对硝基苯酯（p-NP）和系列脂肪酸甲酯标准品都购于Sigma公司。月桂醇醚磷酸酯、十二烷基硫酸钠（SDS）、月桂酸钠（LAS）、吐温80（Tween80）、聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）、乙二胺四乙酸（EDTA）、苯甲基磺酰氟（（PMSF）、Tris（三羟甲基氨基甲烷）、磷酸二氢钠、甘氨酸、氢氧化钠等购于国药集团化学试剂有限公司，以上試剂未经特殊指明均为分析纯试剂。

1.2 重组质粒

pET28a-TLL1的构建根据大肠杆菌优势密码子，对获得的TlLipA氨基酸序列（GenbankNo.SHG68904.1）进行密码子优化，优化的TlLipA基因序列由上海捷瑞生物工程有限公司通过全基因合成。分别以NcoI和EcoRI对TlLipA基因（tll1）及pET28a进行双酶切反应，酶切后将质粒pET28a和tll1连接，转化至大肠杆菌Top10中，经验证，获得正确的重组质粒pET28a-TLL1。

1.3 重组脂肪酶

TlLipA酶学性质的表征方法最适反应温度的测定：在45～85℃温度范围内分别测定酶活力，以最高酶活力为100%计;热稳定性的测定：将酶液于55～70℃分别保温不同时间，测定酶活力，以初始酶活力为100%计。最适反应pH的测定：在pH4.0～11.0范围内分别测定重组脂肪酶TlLipA的酶活力，以最高酶活力为100%计;pH稳定性的测定：将酶液于不同pH缓冲液中室温（25℃）放置1h，测定酶活力，以初始酶活力为100%计。金属离子和化学试剂对酶影响的测定：在反应体系中加入不同的金属离子及化学试剂至其终浓度为1mmol/L，Tween80终浓度为0.05%（质量分数），混合保温1h后，测定酶活力，以加入等量蒸馏水的酶样品为对照。底物特异性的测定：测定重组脂肪酶TlLipA对不同碳链长度对硝基苯酯（p-NP）的偏好特性。测定的底物如下：棕榈酸对硝基苯酯（p-NPP，C16）、肉豆蔻酸对硝基苯酯（p-NPM，C14）、月桂酸对硝基苯酯（p-NPL，C12）、癸酸对硝基苯酯（p-NPD，C10）、辛酸对硝基苯酯（p-NPO，C8）、己酸对硝基苯酯（p-NPC，C6）、乙酸对硝基苯酯（p-NPA，C2）。动力学反应参数的测定：取不同浓度（0.1～2mmol/L）的p-NPP在最适条件下与纯化的TlLipA反应，测定酶活力，用Sigma-Plot软件作图，得出动力学反应参数。

2 微生物脂肪酶的应用

2.1 重组GZEL酶蛋白制备

GZEL在无任何表面活性剂条件下，以三辛酸甘油酯为底物，测定不同pH条件下的脂肪酶活力。结果表明：不同pH条件下的脂肪酶活力呈典型的钟形曲线。脂肪酶活性在pH=5.0条件下最大，为（1.48±0.07）×105U/g;以大豆来源L-α-磷脂酰胆碱为底物时，测得该酶在不同pH条件下的磷脂酶活力曲线，结果表明，在pH=6.0时表现出最大的磷脂酶活性，活力为3506.94±274.47U/g。在无任何表面活性剂存在条件下，脂肪酶GZEL的选择性指数为42.2该结果与之前报道的乳化法测定所得的结果相吻合（41.57）。本文测定GZEL发挥脂肪酶活力的最适反应pH与之前报道的以橄榄油乳化法反应体系测得的结果有所不同（pH7.0）。这可能与反应体系和反应底物不同有关。在本研究中，选取了常见的不同类型表面活性剂：阴离子型：N-月桂酰肌氨酸钠、十二烷基硫酸钠（SDS）、脱氧胆酸钠（NaTDC）;阳离子型：十四烷基三甲基溴化铵（TTAB）、苯扎氯铵（DDBAC）;非离子型：聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）、辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷;两性离子型：3-（胆酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐（CHAPS）、十二烷基磺丙基甜菜碱作为代表。同时每种表面活性剂参照其各自临界胶束浓度值选取三种不同浓度（CMC）来测定不同表面活性剂浓度条件下脂肪酶GZEL在不同pH（2.0～11.0）下对应脂肪酶活力和磷脂酶活力。

2.2 金属离子

铜离子对不同脂肪酶的影响有着很大的不同。铜离子能够激活NCIM3639脂肪酶的活性，但对其他绝大部分脂肪酶都产生抑制作用。而汞离子与铁离子对绝大部分脂肪酶都表现为抑制作用。

结语

在微生物酶的研究内容上，筛选、基因克隆表达和酶的纯化与性质研究是主流，酶催化机理和晶体结构解析等更深入的研究较少，蛋白质工程改造工作也不多。酶分子改造能进一步提高酶的工作效能，而理论研究是蛋白质工程的重要指导，可以预期今后会有更多微生物酶理论研究及分子改造工作。

参考文献

[1] 蔡海莺，王珍珍，张婷，等.微生物脂肪酶资源挖掘研究进展[J].食品科学，2018，39（7）：337-345.

[2] 韦宇拓，滕昆.脂肪酶的分子结构及应用研究进展[J].广西科学，2014（2）：93-98.