兔抗人MiR-338抗体制备与鉴定*

吴大英 张秀艳 李 霞 郭予武

(1深圳市龙岗中心医院；2深圳市龙岗区中医院 广东深圳 518115)

卵巢癌是女性生殖道最常见的恶性肿瘤之一， 其发病率呈逐年上升趋势， 是严重危害人类健康的一类疾病。MiR-338是肿瘤抑制基因，以往的实验结果表明卵巢癌组织MiR-338 mRNA 呈低表达，并且与临床分期、组织分型及淋巴转移有密切关系[1]，且卵巢癌易发生早期侵袭转移，是患者术后高复发乃至死亡的主要原因。MiR-338作为一个肿瘤转移抑制基因，在很多肿瘤的侵袭转移过程中起重要作用，国内外部分学者发现其与肿瘤转移抑制作用存在相悖[2]。深入研究MiR-338基因的表达与卵巢癌侵袭、转移及预后的关系很有必要。抗体是研究免疫分子的重要工具，目前市场上尚未见有商品化的针对MiR-338特异性抗体。课题组通过PCR扩增获取了MiR-338编码区基因，表达其重组蛋白，制备其特异性抗体，同时提出了其应用ELISA方法检测卵巢癌病人血清的可能性。

1材料和方法

1.1材料

卵巢癌组织来自深圳市龙岗中心医院妇产科手术室。大肠杆菌DH5α、大肠杆菌DL21(DE3)为本室保存。雄性新西兰大白兔由深圳市龙岗中心医院实验动物中心提供。克隆载体pGEM-T、反转录试剂盒为Promega公司产品。RNA 提取试剂、表达载体pET28和Ni2+-NTA 凝胶为Invitrogen公司产品。Taq酶和限制性内切酶为大连宝生物工程公司产品。PCR产物回收、质粒纯化试剂盒为QiaGen公司产品。IPTG及DAB购自上海生物工程有限公司。HRP标记的羊抗兔IgG 为Dako公司产品。PVDF膜为美国PALL公司产品。常规试剂为国产分析纯。PCR引物合成及DNA序列测定委托上海生物工程公司完成。

1.2方法

1.2.1 KiSS- 1编码区基因的克隆 ①卵巢癌组织总RNA的抽提和反转录反应：取手术切除的新鲜卵巢癌组织，抽提RNA。②PCR扩增：根据GenBank中MiR-338cDNA序列，设计1对特异引物，引物1：5’-GGC-CGG-CCA-GGA-TCC-ATG-AAC-CAC-TGG-3’(划线部分为NcoI酶切位点)，引物2：5’-GCT-CGA-AGA-CTC-GAG-TCA-CTG-CCC-3’(划线部分为Xhol酶切位点)，用以扩增MiR-338基因。PCR条件设定：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30min，32个循环后，于72℃延伸7min。PCR产物经10g/L的琼脂糖凝胶电泳分析并回收纯化。③MiR-338基因的鉴定：将纯化的PCR产物与pGEM-T载体连接后，转大肠杆菌DH5α化感受态细胞。转化菌液涂布于含氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB平板上，于37℃培养过夜，挑取白色菌落进行培养，提取重组质粒，用EcoRⅠ进行酶切鉴定，阳性克隆进行DNA测序，测序结果与GenBank中的DNA序列进行同源性比较分析，将质粒命名为pGEM-T/MiR-338。

1.2.2原核表达载体的构建 用NcoI和Xhol分别对pGEM-T/MiR-338质粒和原核表达载体pET28进行双酶切，凝胶电泳后，分别切取MiR-338基因片段和pET28片段，回收、纯化目的片段后，用连接酶连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后将菌液涂布于含50 mg/L卡那霉素的LB平板，筛选阳性表达克隆，进一步用PCR和测序进行鉴定，命名为pET28/MiR-338。

1.2.3 KiSS-1 在大肠杆菌中的表达将pET28/MiR-338质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，37℃培养过夜，经PCR筛选及测序鉴定，阳性克隆于37℃振荡培养过夜，以1：50的比例接种到LB液体培养基(含50mg/L卡那霉素)中，培养至菌液的A600值到0.5～0.6时加入IPTG(终浓度为1 mmol/L)，37℃诱导表达6 h，离心收集菌体，超声破碎后，分别取细菌裂解上清、沉淀部分及菌总蛋白进行SDS-PAGE分析，未经诱导的重组菌为对照。

1.2.4重组KiSS-1蛋白的纯化 将工程菌接种于500mL LB液体培养基中进行诱导表达，收获细菌沉淀用50mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)洗涤1次，加入溶菌酶和DNaseI处理后，置冰浴中超声破菌，15 000 g离心收集沉淀，洗涤后，离心获取沉淀，溶于10mL裂解缓冲液(8mol/L尿素，20mmol/L磷酸盐缓冲液，pH7.8)中，上样至Ni2+-NTA 凝胶柱，在杂交条件(hybrid condition)下进行纯化，即在变性条件(denature condition)下上样后，分别用不同pH的变性洗涤液(denature wash buffer)和天然洗涤液(Native wash buffer)洗涤层析柱，最后在天然条件(native condition)下洗脱目的蛋白。

1.2.5抗体的制备及鉴定 将浓缩后的重组蛋白浓度调整为1g/L，与等量的佐剂研磨，用于免疫家兔，具体的制备方法参照文献[3]进行。免疫完毕，经颈总动脉放血、分离血清。用间接ELISA法检测抗体效价，用Western blot对抗体特异性和活性进行鉴定，方法参照文献[3]进行。用人小肠组织作免疫组织化学检测，对抗体的活性和特异性作进一步的分析，多抗按1：300稀释，采用DAB显色。同时以正常家兔血清作对照。

2结果

2.1 KiSS-1编码区基因的扩增

1g/L琼脂糖凝胶电分析PCR扩增产物显示，在450bp上边附近有一条特异条带，与预期的目的片段大小相符，经测序鉴定，得到MiR-338基因片段为452bp，碱基序无突变，阅读框正确，阳性克隆命名为pGEM-T/MiR-338，结果见图1。

图1 琼脂糖凝胶电泳分析KiSS- 1 RT-PCR 扩增产物

2.2表达载体的构建与鉴定

表达载体质粒pET28和克隆质粒pGEM-T/MiR-338经NcoI和Xhol双酶切后，分别回收目的片段，用连接酶连接后，构建表达载体pET28/MiR-338。经PCR和DNA序列测定，证实目的片段大小为452bp的MiR-338编码区基因片段正确插入pET28，碱基序无突变，阅读框正确，可用于下一步的诱导表达。

2.3重组蛋白的诱导表达、纯化与鉴定

最佳诱导条件确定为在28℃条件加入的IPTG终浓度应为0.5mmol/L，最佳诱导时间为5h。诱导表达的MiR-338融合蛋白SDS-PAGE和westernblot鉴定结果，见图2。在Mr约52KD处有一条高表达的外源蛋白条带，与预测的目的蛋白的Mr相吻合，从500mL细菌培养液中纯化得到约3mg蛋白，经凝胶扫描分析显示，所得的蛋白纯度为93%，纯度较高。

图2 MiR-338重组蛋白的SDS-PAGE和抗体特异性的Western blot鉴定分析

2.4抗血清的效价及特异性的鉴定

利用纯化的重组MiR-338为抗原，通过常规免疫家兔，获得兔抗人MiR-338抗体，ELISA检测效价其为1：6400，可用于对抗原进行检测。以制备的兔抗人MiR-338血清作一抗，进行Western blot检测，结果显示，诱导表达菌蛋白及纯化蛋白出现了特异反应条带，而在未加诱导剂的菌体蛋白中未见有反应条带，表明所制备的抗体与人MiR-338特异结合。应用所制备的抗体检测人卵巢癌组织石蜡切片，免疫组织化学染色结果显示，制备的抗体作为一抗有明显的阳性着色，每批染色均用已知阳性切片做阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照，以细胞质和/ 或细胞核内出现棕黄色颗料为阳性细胞。而应用正常家兔血清为一抗则无阳性着色(图3)，说明所制备的兔抗人MiR-338抗体可特异识别天然状态下的MiR-338分子，抗体具有良好的活性和高特异性。

图3 兔抗人MiR-338抗血清特异性的免疫组织化学分析

3 讨论

卵巢癌在妇科恶性肿瘤中的死亡率居首位，尽管目前手术、化疗和放疗技术不断改进，但五年生存率仍无明显提高。因此，若能提高早期卵巢癌的诊断率，即可明显提高卵巢癌的总体治疗效果。因此，目前国内外大量的有关肿瘤标记物，免疫组化水平，基因水平的癌基因与抑癌基因的研究正在进行。

MiR-338是LEE等[4]1996年在黑色素瘤细胞株发现的一个崭新的肿瘤转移抑制基因，定位于1号染色体长臂1q32～q41 区。MiR-338编码一个大小为145个氨基酸的亲水性蛋白，称metastin。MiR-338 蛋白可与Src癌蛋白的同源3号区(Src homology-3，SH-3)位点结合，进而抑制带有SH-3的各种因子参与转移级联反应，从而抑制肿瘤转移。MiR-338基因还可以产生一个羧基端酰化的含有54个氨基酸的残基肽。这个肽是一个崭新的孤儿G蛋白偶联受体(命名为GPR54 或AXOR12)的天然配体，MiR-338编码的残基肽与GPR54结合后激活PLC，PLC的激活可以产生两种重要的细胞内第二信使IP3 和二甘油酯，二者分别促进细胞内钙离子释放和PLC 的活化。细胞内钙离子的增加可以抑制肿瘤细胞增生，诱导肿瘤细胞分化和凋亡[5]。

国内外有研究发现，MiR-338缺失表达与胃癌、食管鳞状细胞癌、胰腺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、膀胱癌和子宫内膜癌等多种恶性肿瘤的侵袭、转移密切相关，MiR-338的缺失是淋巴结转移的重要指标[6-7]。目前有多种学说可以解释MiR-338抑制肿瘤转移的现象，但更多学者认为MiR-338 可能对MMP-9 的表达存在着明显的负调控作用，后者可以降解细胞外基质和基底膜上的胶原、层粘连蛋白和纤维结合蛋白等主要结构。但在卵巢癌发生发展中MiR-338基因的表达到底是怎样的机制？因此深入研究MiR-338基因的表达与卵巢癌的侵袭、转移及预后的关系是必要的。

在实验中，采用手术切除的卵巢癌组织提取总RNA，由于所用的组织选择合理，用RT-PCR技术成功地扩增出452bp的MiR-338编码区基因片段，序列与GenBank上登录序列完全一致。为便于纯化，该实验选用了含6×His的pET28载体。在重组蛋白的制备过程中，发现重组MiR-338蛋白主要以包涵体的形式存在，通过Ni-NTA凝胶亲和层析，经过不同pH的变性缓冲液和天然缓冲液的洗涤后，在天然条件下，用咪唑进行洗脱回收，效果良好。从500mL细菌培养液中纯化得到约3mg蛋白，经凝胶扫描分析显示，所得的蛋白纯度为93%，纯度较高，能用于进一步的相关研究工作。

肿瘤的发生、发展是多基因多因素的综合作用，而每种基因在肿瘤中的作用表型亦受多个因素的调控，从而表现出组织特异性。目前研究认为MiR-338基因的表达缺失与6ql6-q23区杂合性缺失(LOH)有关[8]，该项检测在临床上的研究也还未广泛展开。因此，笔者下一步研究工作是：一方面，着手构建MiR-338真核表达质粒，将质粒转染至卵巢癌细胞株，探讨MiR-338基因在卵巢癌发生发展和淋巴结转移中的机制；另一方面，利用已经制备的抗人MiR-338抗体，为进一步建立MiR-338的的ELISA检测方法奠定了坚实的基础，为卵巢癌的免疫学诊断提供理论依据。