基于网络药理学和分子对接探讨密蒙花颗粒剂治疗干眼的作用机制

欧晨 宋厚盼 李洁 陈向东 彭清华

〔摘要〕 目的 運用网络药理学方法和分子对接技术探究密蒙花颗粒剂治疗干眼可能的作用机制。方法 通过运用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）筛选出密蒙花颗粒剂口服生物利用度≥30%和类药性≥0.18的化合物作为候选药效成分，根据TCMSP的“Related Targets”对密蒙花颗粒剂的活性成分的作用靶点进行预测，采用Cytoscape 3.6.0 软件构建化合物-靶点网络。通过OMIM、DisGeNET数据库查找干眼相关基因，通过STRING 数据库进行蛋白质相互作用分析。通过Venny图将密蒙花颗粒剂活性成分靶点与干眼疾病靶点取交集，得到密蒙花颗粒剂有效活性成分治疗干眼的关键靶点，构建药物-活性成分-关键靶点-疾病网络。使用DAVID数据库对关键靶点进行GO 功能注释和KEGG 通路富集。运用AutoDock vina 1.1.2软件对选取的密蒙花颗粒剂主要活性成分与关键靶点进行分子对接。结果 得到密蒙花颗粒剂对应靶点的活性成分46个，预测作用靶点248个，干眼相关基因237个，密蒙花颗粒剂治疗干眼的关键靶点18个，靶点参与的功能主要有细胞增殖调控、基因表达的调控、细胞凋亡、蛋白磷酸化、免疫反应、衰老、调控细胞炎症相关因子等，作用的主要通路为糖尿病、NOD样受体、Toll样受体、MAPK信号通路等。分子对接的结果显示主要活性成分与获得的有效靶点具有较好结合活性。结论 密蒙花颗粒剂可能主要通过抑制炎症相关因子和通路，减轻泪腺组织的炎症，从而达到治疗干眼的目的。

〔关键词〕 密蒙花颗粒剂;干眼;网络药理学;分子对接;作用机制

〔中图分类号〕R276.7       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.07.005

〔Abstract〕 Objective To explore the possible action mechanism of Mimenghua Granule in the treatment of dry eye by using network pharmacology and molecular docking. Methods Compounds with oral bioavailability of 30% or more and drug-like ratio of 0.18 or higher in Mimenghua Granule were screened as candidate drug-effect ingredients by TCMSP database， and then predict the target of active ingredients of Mimenghua Granule according to "Related Targets" of TCMSP. The compounds-target interaction network was constructed by Cytoscape 3.6.0. The genes for dry eye was searched by OMIM and DisGeNET， and protein interaction analysis was performed through STRING database. The target of active ingredients of Mimenghua Granule intersects with the target of dry eye through the Venny diagram. The key targets of effective active ingredients of Mimenghua Granule to treat dry eye were obtained， and the drug-active component-key target-disease network was constructed. DAVID was used to perform GO function annotation and KEGG pathway enrichment on key targets. The main active components of Mimenghua Granule and the main target were performed molecular docking by AutoDock vina 1.1.2. Results Totally 46 active ingredients， 248 predicted targets， and 237 genes related to dry eye were identified. 18 key targets of Mimenghua Granule to treat dry eye were obtained. The targets were involved in regulation of cell proliferation， gene expression， cell apoptosis， protein phosphorylation， immune response， aging， regulation of cell inflammation-related factors， etc. The main pathways of action were diabetes mellitus， NOD-like receptor signaling pathway， Toll-like receptor signaling pathway， MAPK signaling pathway. The results of molecular docking showed that the main active components had good binding with the effective target. Conclusion Mimenghua Granule may reduce inflammation of lacrimal tissue through inhibiting inflammatory related factors and pathways to treat dry eye.

〔Keywords〕 Mimenghua Granule; dry eye; network pharmacology; molecular docking; action mechanism

干眼是以泪膜稳态失衡为主要特征并伴有眼部不适症状的多因素眼表疾病，泪膜不稳定、泪液渗透压升高、眼表炎症与损伤以及神经感觉异常是其主要病理生理机制[1]。临床表现为眼干燥感、异物感、烧灼感、畏光、视物模糊，严重者视力明显下降，自觉症状重，影响工作和生活[2]。目前治疗干眼的主要药物有人工泪液、局部抗炎及免疫抑制剂、自体血清。但从药物相关的治疗效果来看，仅局限于改善临床症状、延缓病情进展，且上述药物的靶向性均较单一，因此亟需寻找新的思路解决这一问题。而中药治疗干眼以滋阴润肺、清肝解郁、益气养阴、滋补肝肾为主，在临床上取得了较好的疗效。现代药理学研究发现，中药在防治干眼方面具有独特的优势和广阔的发展前景[3]。

彭清华教授根据多年临床经验，结合干眼的发病机制，创制了密蒙花颗粒剂。密蒙花为传统中药中重要的眼科用药，具有疏风清热、养肝明目、退翳的功效，用于目赤肿痛、多泪羞明、眼生翳膜、肝虚目暗、视物昏花等症状。其主要含黄酮类、苯乙醇苷类和萜类等成分，具有抗炎、抗菌、免疫调节、抗氧化等生理活性。本团队前期临床和实验研究证实密蒙花对干眼有良好的治疗作用[4-6]。枸杞子能滋补肝肾、益精明目，菊花有疏风散热、平肝明目之功。前期实验研究证明密蒙花颗粒剂可以通过抑制泪腺组织中炎性因子IL-6、IL-12、TNF-α、IL-1β的表达减轻泪腺组织的炎症，达到治疗干眼症的目的[7-8]。

中药网络药理学是在传统经验、科学假说的基础上，从实验数据或文献、数据库中提取中药成分、靶点、基因、通路、疾病等为关键要素，并以此关键要素为节点，通过计算节点间相互关系，模拟构建机体分子关联网络模型，探究生命活动的本质、药物与机体相互作用机制[9]。其优势在于可从蛋白、分子和基因等多层面揭示药物对机体的作用及其机制，使研究具有靶向性。中药具有多成分、多靶点的特征，而网络药理学这种多靶点、多途径和多层次的评价系统方法在中药的研究中有较好的预测作用，更加切合中医药的学术特点和实际情况，为解决现代中药研究的热点问题发挥了巨大的作用[10]。分子对接技术是一种能快速准确地预测蛋白-配体复合物结合构象和亲和力的重要研究技术，可对药物活性成分作用于疾病靶点进行预测分析。本研究采用网络药理学方法和分子对接技术深入挖掘密蒙花颗粒剂的主要活性成分及治疗干眼可能的作用靶点，阐述其作用机制。

1 资料与方法

1.1  药物活性成分及靶蛋白的筛选

本研究通过检索中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）对密蒙花颗粒剂所有成分数据库进行了筛选。根据药代动力学参数确定口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、药物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18作為化合物分子的筛选条件[11]。同时根据TCMSP的“Related Targets”对密蒙花、枸杞子、菊花的活性成分的作用靶点进行预测，对部分TCMSP没有预测靶点的化合物检索ETCM数据库（http：//www.nrc.ac.cn：9090/ETCM/）对其靶点进行补充，最后将所有得到的靶点利用STRING进行格式转换。使用Cytoscape 3.6.0软件对密蒙花颗粒剂活性成分与预测靶点绘制化合物-靶点网络图。

1.2  干眼相关基因查询

运用OMIM（https：//omim.org/）、DisGeNET （http：//www.disgenet.org/）数据库检索“dry eye”，获取干眼的相关基因。将这些基因靶点导入STRING 11.0 （http：//string-db.org/），获得蛋白质相互作用（PPI）网络。

1.3  获取密蒙花颗粒剂治疗干眼的关键靶点

将密蒙花颗粒剂活性成分靶点与干眼疾病靶点取交集，得到密蒙花颗粒剂有效活性成分治疗干眼的关键靶点。

1.4  构建药物-活性成分-关键靶点-疾病网络

使用Cytoscape 3.6.0软件构建药物-活性成分-关键靶点-疾病网络图，其中节点的类型有中药、成分、靶点、疾病。

1.5  GO功能富集分析

GO是注释基因及其表达产物的常用方法，由生物过程（BP）、细胞组成（CC）和分子功能（MF）3部分组成[11]。运用DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）对得到的密蒙花颗粒剂治疗干眼的关键靶点进行GO功能分析，说明其在基因功能中的作用。

1.6  KEGG通路富集分析

运用DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）对得到的密蒙花颗粒剂治疗干眼的关键靶点进行KEGG通路富集分析，从而了解密蒙花颗粒剂治疗干眼可能发生改变的关键信号通路。

1.7  密蒙花颗粒剂主要活性成分与干眼主要靶点分子对接

通过pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）检索获取密蒙花颗粒剂主要活性成分的3D结构，从Protein Data Bank（http：//www.rcsb.org/pdb）中检索获得关键靶点的受体蛋白，利用PYMOL 2.3.4软件对受体蛋白进行去水、去配体等操作，采用AutoDock 4.2.6软件对受体蛋白进行加氢以及计算电荷处理，设置受体蛋白对接格点参数将小分子配体可能结合的活性口袋位点包含，利用AutoDock Vina 1.1.2对受体蛋白与配体小分子分别进行分子对接，对接获取构象并进行结合能打分，取结合能最好的进行作图分析，采用PyMOL作三维图显示受体蛋白与配体小分子之间的相互作用。

2 结果

2.1  密蒙花颗粒剂活性成分及相应的靶蛋白

初步筛选出密蒙花化学成分46种，枸杞子化学成分188种，菊花化学成分359种。其中OB≥30% 的成分共有270种，DL≥0.18的成分共有288种。通过OB、DL条件共筛选，删除重复的5个化学成分，共有46个活性成分有良好的口服利用度和类药性。其中OB值最大的为柚皮素，有59.29%;DL值最大的为环桉烯醇、（24r）-马尾藻甾醇，为0.79。运用Cytoscape 3.6.0软件对密蒙花颗粒剂活性成分与预测靶点绘制化合物-靶点网络图，见图1。删除重复靶点后剩余靶点248个，密蒙花颗粒剂活性成分与靶点间存在867条互相作用关系。分析得出密蒙花颗粒剂中主要的化学成分为槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、柚皮素等。见表1。

2.2  干眼基因蛋白相互作用网络构建

分别通过OMIM、DisGeNET数据库检索到RP相关基因182个和61个。使用STRING 11.0绘制干眼蛋白相互作用关系图（见图2）。该网络图中包含237个表示靶蛋白的节点和853条表示相互作用关系的线，平均每个蛋白节点有7.2条互相作用的关系线。

2.3  密蒙花颗粒剂治疗干眼的关键靶点

将密蒙花颗粒剂活性成分对应的248个有效靶点与通过STRING 11.0得出的237个疾病有效靶点取交集。得出了18个密蒙花颗粒剂治疗干眼的关键靶点，分别是TGFB1、IL1A、AR、IL1B、CASP8、EGFR、CXCL8、IL6、CCL2、IFNG、PTGS2、ICAM1、MMP9、SELE、ESR1、CHRM3、SOD1、SOAT1。

2.4  药物-活性成分-关键靶点-疾病网络构建

图3中红色代表中药密蒙花、枸杞子、菊花，黄色代表干眼，蓝色代表密蒙花颗粒剂的活性成分，紫色代表中药-疾病共同作用靶点。中药密蒙花颗粒剂主要通过19种活性成分作用于18个靶点来治疗干眼疾病，其中与活性成分连接较多的靶点为PTGS2、AR。

2.5  GO功能富集分析

运用DAVID 数据库对密蒙花颗粒剂治疗干眼的18个关键靶点进行GO 功能富集分析，共收集到44条。其中包括生物过程34条，分子功能6条、细胞组成4条。主要涉及细胞增殖调控、基因表达的调控、细胞凋亡、蛋白磷酸化、免疫反应、衰老、调控细胞因子（NF-？资B、白介素6、白介素1、蛋白激酶B）等生物学过程，主要富集于细胞外、细胞质、细胞核等区域，分子功能包括细胞因子活性、酶结合、相同蛋白结合、锌离子结合等。通过Omicshare平台对结果进行可视化处理，气泡图见图4。

2.6  KEGG通路富集分析

运用DAVID 数据库对密蒙花颗粒剂治疗干眼的18个关键靶点进行KEGG 通路富集分析，得到了23条信号通路。包括类NOD样受體、Toll样受体、糖尿病、MAPK信号通路。气泡图见图5。

2.7  密蒙花颗粒剂主要活性成分与干眼主要靶点分子对接

选取密蒙花颗粒剂中5个最主要的化学成分quercetin、kaempferol、luteolin、beta-sitosterol、naringenin，与“2.4”中得出的密蒙花颗粒剂治疗干眼的关键靶点PTGS2（PDB ID： 5F1A）、AR（PDB ID： 5V8Q）进行分子对接。PTGS2与主要化学成分的结合能分别为-9.7、-9.5、-9.8、-8.5、-9.5 kcal/mol，AR与主要化学成分的结合能分别为-8.3、-8.7、-9.8、-8.9、-7.9 kcal/mol。luteolin与两个受体蛋白的结合能最好，均为-9.8 kcal/mol。图6为luteolin配体小分子和受体蛋白AR之间的结合模式，氨基酸残基Asn705、Arg752与luteolin配体小分子形成氢键相互作用，氨基酸残基Met787、Leu873、Met780、Thr877、

Leu880、Leu701、Leu704、Leu707、Gln711、Phe764、Val746、Met749与luteolin配体小分子形成疏水相互作用，图7为luteolin配体小分子和受体蛋白PTGS2之间的结合模式，氨基酸残基Arg125、Arg44、Glu465、His39与luteolin配体小分子形成氢键相互作用，氨基酸残基Thr130、Val46、Pro153、Cys41、Gln461、Leu152、Arg469与luteolin配体小分子形成疏水相互作用。

3 讨论

本研究以密蒙花颗粒剂作为药物，研究其治疗干眼的作用机制。运用网络药理学方法分析密蒙花颗粒剂包含的药物密蒙花、枸杞子、菊花的有效成分，构建密蒙花颗粒剂活性成分-靶点网络，分析密蒙花颗粒剂活性成分与靶点之间的相互关系。其中密蒙花颗粒剂活性成分-靶点网络中的关键成分是槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、柚皮素。槲皮素是一种黄酮类化合物，具有显著的细胞保护、抗氧化作用。柚皮素是柚皮甙的甙元，具有抗菌、抗炎、抗氧化、解痉和利胆等作用。有研究表明，槲皮素和柚皮素均可通过降低炎症反应来减轻神经病理学疼痛[12-13]。木犀草素、柚皮素等在眼科领域中进行了大量的研究，均取得了较好的疗效[14-15]。本研究得出密蒙花颗粒剂治疗干眼的18个关键靶点，其中PTGS2被发现与干眼有关，有研究使用PTGS2抑制剂作用于干眼小鼠模型，显示其通过参与免疫炎性反应治疗干眼[16]。大量研究报道AR影响眼组织的组织结构和功能活动，可治疗干眼，人泪腺、睑板腺、角膜、球结膜、晶状体上皮细胞、视网膜色素上皮细胞等多种眼组织可能是AR作用的靶部位[17]。本研究团队证实L1B、IL6、ICAM1、CASP8、MMP9在密蒙花颗粒剂治疗干眼的过程中发挥着重要作用[4-7，18]。

为了说明筛选出的关键靶点在基因功能和信号通路中的作用，本研究进行了GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。分析得出密蒙花颗粒剂主要通过细胞增殖调控、基因表达的调控、细胞凋亡、蛋白磷酸化、免疫反应、衰老、调控细胞炎症相关因子等生物学过程治疗干眼疾病。大多数基因可富集到糖尿病、NOD样受体、Toll样受体、MAPK信号通路。糖尿病与干眼关系密切，糖尿病干眼症是糖尿病的慢性并发症之一，与单纯的干眼相比临床表现更为严重。NOD样受体、Toll样受体分别作为胞外和胞内模式识别受体在炎症反应中起到重要作用。MAPK信号通路可参与炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等多种病理生理过程，密蒙花颗粒剂已证实可通过干预MAPK信号通路来阻断相关炎症反应，从而改善眼表症状[5]。从分子对接结果可知，密蒙花颗粒剂中的5个最主要的活性化合物与关键靶点PTGS2、AR的结合能均小于-7 kJ/mol，表明这些化合物可能直接作用于PTGS2、AR，从而治疗干眼。

综上所述，本研究运用网络药理学方法和分子对接技术，初步探究了密蒙花颗粒剂多成分、多靶点、多通路的复杂机制过程。发现密蒙花颗粒剂发挥作用的主要生物活性成分槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、柚皮素，密蒙花颗粒剂治疗干眼的作用机制涉及细胞增殖调控、基因表达的调控、细胞凋亡、蛋白磷酸化、免疫反应、衰老、调控细胞炎症相关因子等，作用的主要通路为糖尿病、NOD样受体、Toll样受体、MAPK信号通路等。分子对接的结果显示主要活性成分与获得的有效靶点具有较好结合活性。本研究可为密蒙花颗粒剂治疗干眼提供一定的依据，为进一步实验研究提供研究方向，也可为临床治疗干眼及新型药物的开发提供思路。

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