利用肝前体细胞治疗肝纤维化

李为雨 杨爱婷 尤红

肝纤维化是肝损伤后细胞外基质沉积或瘢痕形成的动态过程，可持续进展为肝硬化，甚至肝癌等终末期肝脏疾病。美国食品和药物管理局(FDA)目前尚无批准用于治疗肝纤维化的药物，现阶段肝移植是少数发生肝硬化相关并发症(例如肝癌和肝衰竭)的患者唯一的治疗手段。但由于器官短缺的客观问题存在，促进成人肝脏修复和再生的特异细胞和分子机制的研究迫在眉睫。同时，对于机制的进一步研究有助于确定临床治疗靶点。

成年人急性肝损伤后，肝细胞的再生往往通过剩余健康肝细胞和胆管细胞的增殖和扩增实现，而肝前体细胞的参与则很少。相比之下，慢性肝损伤的修复涉及肝前体细胞的增殖和具有一定干细胞样特性的细胞向肝细胞和胆管细胞分化，从而支持肝功能的恢复[1-2]。目前，虽已发现多种前体细胞的标记，但没有一个完全特异。最近的研究表明，肝脏前体细胞实际上是一个包含多种细胞类型的异质性群体，从原始的前体细胞到更为分化的细胞(如肝细胞样)均包含在内。事实上，在成年小鼠中，前体细胞包括胆汁样细胞(在啮齿类动物中也被称为“椭圆形细胞”)、中央静脉周围的前体细胞、去分化的肝细胞或胆管细胞、以及显示出免疫调节特性的多潜能间充质干细胞(MSC)[2-3]。 人类身上亦可出现类似的异质性现象。EpCAM+/NCAM+双功能前体细胞存在于胎儿时期的肝板中，随后保留在成人肝脏的胆小管中。这类前体细胞共表达与肝脏和胆管相关的基因(例如SOX9、HNF1B、K19、CD24、CD133、K7和OPN)[3]。在损伤过程中，成熟的肝细胞和胆管细胞也可 “转分化”，从而产生混合双能前体细胞，因此导致不同类型的肝细胞之间的“标志物”表达有很大的重叠。由于特异性抗体的缺乏以及免疫标记有限的解析率，因此成人肝细胞的身份和来源往往出现明显矛盾的报道。现如今，单细胞转录组学的出现使我们有望能更准确地定义这些前体细胞群体。如肝星状细胞(HSCs)一直被认为是肝纤维化过程中表达出肌成纤维细胞(MFs)的主要来源， 但最近在一种啮齿动物肝纤维化模型中进行的单细胞RNA测序研究表明，MFs实际上是一个异质性群体，即HSC共同表达MSC的标志，HSC衍生的MFs才是有助于肝脏再生的多潜能前体细胞[4]。这些新方法也可以帮助阐明内皮细胞和骨髓来源的前体细胞在纤维化和修复中的作用。

Dai的团队证明(人工诱导的)扩大的肝前体细胞群可以改善两种小鼠模型的肝纤维化，增进了我们对“前体细胞相关修复”的理解[5]。具体来说，他们发现HSC衍生的生长分化因子11(GDF11)直接增加了富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(Lgr5)及前体细胞的数量，而这些前体细胞亦表达其干细胞标记，如CD133和EpCAM，以及胆管细胞标志物Keratin19和肝细胞标志物肝细胞核因子(HNF)4A[3]。他们进一步指出，在体外实验中向MFS中添加Lgr5阳性前体细胞显著抑制纤维形成。同时，将Lgr5阳性的前体细胞注射到CCl4和DDC处理的小鼠中时，小鼠体内纤维化减轻。而重组GDF11治疗或GDF11过表达的Lgr5阳性前体细胞进一步抑制了纤维化形成。相反，在小鼠中敲除Lgr5阳性前体细胞群肝纤维化进一步进展(图1)。

虽然上述结论令人信服，但也依旧留下了一些问题，即Lgr5阳性前体细胞通过什么潜在机制减少肝纤维化？此外，在慢性肝损伤过程中观察到的胆管反应(在小鼠中也称为肝前体细胞反应)是可预测性的，并与肝纤维化相关。Coombes等[6]先前报道SOX9+OPN+K19+肝前体细胞可以分泌OPN，进一步激活HSC分化成MF。Machado和Diehl也在一系列报道中证明，肝前体细胞和HSC-MF都可以分泌Hedgehog配体来自我调节和放大纤维化结局[7]。我们如何才能调和肝脏结局中的这些明显差异？或许是因为这些研究中使用的前体细胞群体彼此不同，Dai和他的同事们揭示了“其他兼性干细胞”可能正在发挥抗纤维化作用。

决定肝脏预后的另一个因素是微环境，即在损伤和修复过程中存在或不存在其他细胞和分子信号，单个前体细胞亚群可能受到不同的调节。转化生长因子β(TGF-β)家族蛋白在创伤愈合和发育过程中起着重要作用，GDF11是其中之一。GDF11此前已被报道可调节发育中的视网膜中的前体细胞生长，证实过表达GDF11可以防止肝纤维化[5]。然而，TGF-β家族的成员在功能上经常表现出明显两极分化。例如，骨形成蛋白(BMP)-9在肝损伤的早期下调，在肝损伤的后期，在组织的再分化过程中上调，在纤维化模型中抑制BMP-9可以抑制疾病的进展[8]。另一项研究进一步表明，BMP-9通过负调控卵圆细胞，部分诱导肝纤维化[9]。相反，使用另一种小鼠品系(129/Ola)的研究表明，BMP-9抑制了肝窦内皮细胞的毛细血管化[10]。除了TGF-β之外，OPN也具有类似的特点。例如，OPN基因敲除的小鼠在CCl4模型中相较野生型小鼠出现了更多的纤维化，但在饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)中纤维化程度较轻，并且OPN的生物学功能在疾病的早期和晚期也可能有所不同[6-7]。因此，可以想象，在HSC-MF中过表达GDF11(其效应压倒了OPN、Hedgehog、BMPs和其他促纤维化配体)会导致趋向恢复的特定前体细胞群体的扩张。由于肝前体细胞分泌一系列趋化因子(包括CXCL16、MCP1、CCL17和CCL20)，招募免疫细胞来协调修复相关的炎症反应，GDF11(过)富集的微环境也可能刺激趋化因子的前体细胞分泌趋化因子，这些趋化因子优先招募和保留纤维降解免疫亚群(例如Ly6C低巨噬细胞)。

(A)富含促纤维化因子(或低GDF11水平)的肝脏微环境可激活静止的星状细胞(HSC)向产生胶原的成纤维细胞转变，并通过招募促纤维化免疫亚群直接或间接地刺激肝脏前体细胞增强成纤维;(B)当GDF11水平较高时，肝脏微环境的纤维化程度较低(或更新程度较高)。高水平的肝星状细胞来源的GDF11促进抑制纤维形成的肝前体细胞的扩展，也可能增加疤痕消除免疫亚群的招募。

综上所述，利用肝前体细胞治疗肝纤维化是有希望的方案，但仍有很多工作要做。除了更精确地识别各种肝脏前体细胞亚群，我们还需要更好地理解细胞和分子信号如何在体内平衡和疾病条件下整合，以调节修复和再生。这一点对人类尤其重要，因为慢性肝病的发病过程通常是长期的，而肝脏前体细胞在人类慢性肝病中的作用尚不清楚。