新型冠状病毒S蛋白RBD肽段的原核表达与纯化

侯江厚 ，张灵霞 ，黄国红 ，詹晓燕 ，杨奕梅

1.昆明市妇幼保健院，云南 昆明 650013；2.解放军总医院 第八医学中心，北京 100091

新型冠状病毒病（COVID-19）是由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染引起的一种传染性极高的呼吸系统性疾病，自2019年12月出现以来，该病在全球范围内迅速蔓延。重症COVID-19患者可导致多器官损伤和衰竭，最终死亡[1]。目前，针对COVID-19的治疗还没有特效药物，病毒的传染源、中间宿主以及潜伏期等诸多因素的不明确也将导致本次新冠疫情的防控面临巨大的压力和挑战，因此，研发高效的抗病毒药物是对抗SARS-CoV-2感染的关键。SARS-CoV-2的基因图谱、蛋白结构和入侵受体等生物学相关机制都相继被快速探明，为抗病毒药物的研发奠定了基础[2]。SARS-CoV-2表面的刺突（spike，S）蛋白是病毒打开宿主细胞大门的“钥匙”，S蛋白通过与宿主细胞表面的血管紧张素转换酶2（angioten⁃sin converting enzyme 2，ACE2）受体结合，介导SARS-CoV-2感染的第一步[3]。自然状态下S蛋白以一种相对稳定的同源三聚体形式存在，当S蛋白与ACE2结合时，S蛋白三聚体与ACE2二聚体之间有多个基团相互作用，促进细胞内吞而增强病毒入侵过程。S蛋白由S1和S2两部分组成，其中S1组成棘突的头部，受体结合域（receptor binding domain，RBD）位于S1区域表面，其受体结合基序（receptor binding motif，RBM）仅有数个氨基酸[4]。阻断病毒和宿主细胞受体的结合可以阻止病毒入侵，是抗病毒药物研发策略之一，阻断S蛋白RBD是阻止SARS-CoV-2感染的关键，是抗COVID-19药物研发的重要靶点。抗体或小分子化合物通过与S蛋白RBD靶向结合，抑制或阻断RBD与ACE2的结合，从而抑制SARS-CoV-2进入宿主细胞，避免宿主细胞感染[5]。

为了获得RBD完整肽段，我们利用原核表达系统，采用基因重组方法获得重组RBD肽。蛋白的天然构象是保持该蛋白天然活性的前提，结构中二硫键的正确配对往往代表着蛋白正确的空间折叠方式。为了获得具有天然构象的RBD肽并提高重组蛋白的表达量，我们采用与DsbC蛋白融合表达的方式，充分利用DsbC分子伴侣和二硫键异构酶的作用[6]。同时，为了得到没有冗余氨基酸的RBD肽，以便在后续抗体制备、配基筛选及抗病毒药物筛选时能够提高特异性，在其氨基酸序列的N端引入肠激酶位点，通过原核重组表达并采用肠激酶酶切和二次纯化的方法获得高纯度的RBD肽。本研究获得的RBD肽位于S蛋白Gly319～Asn541，全长223个氨基酸残基。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌BL21（DE3）及其感受态细胞、原核表达载体pET-DsbC由本室制备保存；全基因与引物合成、测序由北京华大基因公司完成；PCR试剂购自上海生工生物有限公司；质粒提取、胶回收等常规分子生物学实验试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；限制性内切酶、T4DNA连接酶购自NEB公司；蛋白质相对分子质量marker购自北京索莱宝生物公司；重组肠激酶由本室表达纯化；Ni-Sepharose chelating Sepharose Fast Flow亲和树脂填料购自中原合聚生物科技公司，本室装填纯化柱；LB培养基、PBS缓冲液配制试剂等其他试剂为进口或国产分析纯产品。

1.2 全基因与引物合成

参照GenBank登录号（MN908947.3）对SARSCoV-2的S蛋白氨基酸序列进行分析，其RBD氨基酸为Gly319～Asn541。为了获得没有冗余氨基酸的RBD，保持此肽段正确的空间折叠和生物活性，选定此区域肽段，同时在N端加入肠激酶序列DDDDK。融合蛋白对应的核酸序列按照利于原核表达系统表达的原则进行优化和全基因合成，在对应的核酸两端分别加入限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ位点序列，3'端加入大肠杆菌终止密码子taa。

1.3 pET-DsbC-RBD表达载体的构建与鉴定

用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ双酶切全基因合成的克隆载体pUC-RBD，紫外灯下切下RBD核酸片段并进行胶回收，对表达载体pET-DsbC同样以HindⅢ和XhoⅠ进行双酶切和胶回收，16℃条件下采用T4DNA连接酶对核酸片段和酶切后的载体进行混合连接过夜，连接产物转化感受态大肠杆菌BL21（DE3），铺含卡那霉素的固体平板，次日挑选克隆进行菌落PCR，筛选阳性克隆，PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳，判断产物大小。对阳性克隆扩大培养并测序，测序正确的菌株保存备用。

1.4 DsbC-RBD融合蛋白的原核重组表达与初步纯化

取测序正确的阳性工程菌株于37℃振荡过夜培养进行活化，隔日按1∶100的比例转接至含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中扩大培养，检测细菌生长密度，菌液D600nm值约为0.4时加入IPTG（终浓度为0.5 mmol/L），30℃振荡诱导10 h，6000 r/min离心5 min收集菌体，加入1×PBS充分混匀，在冰水状态下超声波破碎菌体，12 000 r/min离心30 min，分别取上清和沉淀进行12%的SDSPAGE，分析重组DsbC-RBD的表达形式。

取超声波破碎后的离心上清，以1 mL/min的速度结合镍离子螯合的亲和层析柱，PBS缓冲液缓慢平衡层析柱5个柱体积至基线处于水平状态，以50 mmol/L咪唑除去菌体自身杂蛋白，150 mmol/L咪唑洗脱收集目的蛋白，收集2次的洗脱液加入变性缓冲液，煮沸10 min，12% SDS-PAGE分析重组DsbC-RBD的纯度。纯化后的重组蛋白以水充分透析，冻干保存。

1.5 重组DsbC-RBD融合蛋白的肠激酶酶切

取冻干后的DsbC-RBD粉末，用PBS稀释至1 mg/mL，加入肠激酶，比例为 1∶3000，充分混匀。为了最大限度地保持RBD肽的生物活性，选择酶切温度为4℃，酶切时间为隔夜10 h，酶切后取混合样品进行15% SDS-PAGE分析酶切效率、酶切特异性和目的蛋白RBD的相对分子质量。

1.6 目的RBD肽的二次亲和纯化

分子伴侣蛋白DsbC和肠激酶的N端均带有6×His标签，通过亲和柱层析除去酶切后的DsbC蛋白和肠激酶，采用镍离子螯合的亲和层析方法对酶切后的RBD肽混合液进行分离提纯。取酶切后融合蛋白混合液，以1 mL/min的速度重复结合镍离子螯合的亲和层析柱3次，小心收集穿过液，取穿过液，15% SDS-PAGE分析纯化后RBD肽的纯度和相对分子质量，计算目的蛋白RBD肽酶切后的纯化得率，对纯化后的RBD肽充分水透析后，冻干保存备用。

2 结果

2.1 SARS-CoV-2 S蛋白RBD全基因合成

参考GeneBank公布的SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列，选择Gly319～Asn541序列，根据有利于原核系统表达的原则，采用氨基酸密码子同义置换，对RBD肽段对应的核酸进行全基因合成，在该肽段的N端加肠激酶序列DDDDK。合成的序列全长包含699个核苷酸，序列如下：

2.2 重组pET-DsbC-RBD表达载体的构建与鉴定

用内切酶HindⅢ和XhoⅠ双酶切合成载体pUC-RBD，将酶切的RBD核酸片段克隆到表达载体pET-DsbC上，转化大肠杆菌BL21（DE3），铺固体平板，以合成的鉴定引物采用菌落PCR方法筛选阳性克隆，1%琼脂糖凝胶电泳结果如图1，在预期的约700 bp处有单一条带，经测序与合成序列完全一致。

2.3 DsbC-RBD融合蛋白的原核表达及亲和纯化

取测序正确的工程菌株扩大培养，30℃条件下隔夜诱导，取诱导后的菌体超声波破碎，高速离心30 min后，取上清和沉淀进行12%的SDS-PAGE，结果如图2。融合蛋白的相对分子质量为58×103，和预期一致，表达量占菌体总蛋白的30%以上，分别存在于超声波裂解后的上清和沉淀中。由于可溶性表达往往代表蛋白正确的折叠方式，RBD上清存在形式保证结构区的空间构象，保证后期抑制剂筛选的特异性。

取超声波裂解后的上清，以缓慢的速度流经His标签亲和层析柱，再用PBS缓冲液平衡到基线水平，分别用50 mmol/L咪唑洗脱杂蛋白、150 mmol/L咪唑洗脱收集目的蛋白，12% SDS-PAGE结果如图3。经亲和层析后，DsbC-RBD融合蛋白纯度在90%以上，纯化后的融合蛋白经水透析，冻干保存。

2.4 DsbC-RBD重组融合蛋白的肠激酶酶切

图1 RBD核酸片段菌落PCR凝胶电泳鉴定结果

图2 DsbC-RBD原核表达产物表达形式分析

图3 DsbC-RBD融合蛋白亲和纯化电泳分析

充分考虑酶切后RBD肽段的生物功能，避免较高温度对RBD肽段生物活性的影响，肠激酶酶切只在4℃条件下进行，酶切时间设为8 h。取酶切后混合样品以15% SDS-PAGE分析，结果如图4，此条件下酶切效率为100%，没有产生非特异酶切现象，酶切后显示RBD肽相对分子质量约为25×103，与理论值一致。

2.5 重组RBD肽的纯化

采用镍离子螯合亲和层析对酶切后蛋白混合液中的RBD肽进行分离提纯，肠激酶酶切后蛋白混合液以缓慢的速度反复结合亲和层析柱，收集流穿液以15% SDS-PAGE鉴定回收RBD肽的纯度，结果如图5，纯化后的RBD肽相对分子质量约为25×103，同预期一致，经考马斯亮蓝染色鉴定，纯度大于92%，计算得率为30%，得率较低。

3 讨论

图4 DsbC-RBD融合蛋白肠激酶酶切电泳分析

图5 RBD肽亲和纯化电泳分析

阻断病毒和宿主细胞受体的结合可以阻止病毒入侵，是抗病毒药物研发策略之一，包括靶向病毒或宿主细胞的受体。SARS-CoV-2具有传染性极强和潜伏时间长短不一的特点，同时，病毒真正的传染源及中间宿主也未明确，病毒存在变异风险等，都导致SARS-CoV-2疫情防控具有诸多不确定因素，因此研发SARS-CoV-2预防和治疗性疫苗或高效抗病毒药物迫在眉睫。目前COVID-19仍没有特异治疗方法和抗病毒治疗药物，MARS-CoV的动物模型研究和COVID-19疫情中康复病人血清的救治均显示，阻断入侵策略对冠状病毒可能有效，S蛋白RBD的阻断是阻止SARS-CoV-2感染的关键，是抗COVID-19药物研发的重要靶点。SARS-CoV-2的S蛋白是一种糖蛋白，有3个RBD，内部有二硫键连接，在β冠状病毒属中保守[7]。RBD结构靠近cryo-EM三聚体的中央部位，使S蛋白形成易于和宿主受体ACE2结合的空间构象，SARS-CoV-2与受体ACE2的结合能力比SARS-CoV更强，更具传染性[8]。RBD是诱导抗体产生，阻断病毒结合，刺激宿主免疫反应、中和抗体及保护免疫系统免受病毒感染的主要抗原成分。抗体或小分子化合物通过与S蛋白RBD的靶向结合，抑制或阻断RBD结合功能，可特异性阻断RBD与ACE2的结合，从而抑制SARS-CoV-2进入宿主细胞，避免宿主细胞感染。

目前已有商品化的RBD肽，但价格较昂贵，同时大都采用与人Fc蛋白融合表达，主要用于抗原抗体血清学检测，而高纯度的RBD肽是后续抗体制备、配基筛选和药物筛选验证的基础和保证。为了获得高纯度的重组RBD肽，我们根据原核系统的特点对氨基酸的密码子组成进行了同义置换，以利于原核系统的表达；原核系统内的高表达是后续纯化获得高纯度重组蛋白的基础，采用融合表达方式，兼并考虑RBD肽存在的二硫键，在RBD的N端加入同时具有伴侣蛋白和二硫键异构酶作用的DsbC蛋白进行融合表达，使得融合蛋白的表达量达到总蛋白的30%以上，并获得了部分可溶性表达，提示获得的RBD肽可能具有天然空间结构和正确的二硫键配对；其次，在RBD肽的N端加入肠激酶切点，在目前已经很成熟的肠激酶酶切工艺下，通过二次纯化获得了重组RBD肽，该重组RBD肽不含冗余氨基酸，具有结构完整性，在抗体制备和抗病毒药物筛选时将具有较强的特异性。本方法获得的RBD肽纯度为92%，水溶性较好，但得率较低。高纯度的RBD肽为随后开展以RBD肽为靶标进行相关抑制剂筛选和机制研究提供了可靠的保证，也为临床以RBD肽为重组抗原进行血清学抗体诊断提供了原料。