岩白菜素新颖衍生物合成及其镇咳祛痰活性

2020-08-12周金娜张荣平杨为民陈德云段文越

昆明医科大学学报 2020年8期

周金娜，张荣平，邹澄，杨为民，何波，陈德云，段文越

（昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南昆明 650500）

岩白菜素（Bergenin）作为天然的次生代谢产物，来源于多种植物。岩白菜素属二氢异香豆素类化合物，过去尚有岩白菜内酯，鬼灯聚素，岩白菜宁，佛手配质等异名，溶解性极差[1]。现代药理研究证实岩白菜素具有抗炎，抗肿瘤，抗心律失常，镇咳祛痰等活性[2-5]。岩白菜素的药代动力学研究表明其生物利用度较低，为了充分发挥岩白菜素的药用价值，提高其生物利用度以及生物活性，不少研究者对岩白菜素进行结构改造[6-11]，其中，通过Mannich 反应合成的化合物能增加岩白菜素的水溶性及其活性。因此，本文将岩白菜素与芳基重氮盐反应生成新颖偶氮衍生物，且根据重氮化偶合反应机理，针对岩白菜素分子中苯环的7 位进行结构修饰，生成岩白菜素偶氮衍生物。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

昆明种小鼠，雌雄各半，体重18～22 g。由昆明医科大学动物实验中心提供。

FA2004 电子天平（上海瞬宇恒平科学仪器有限公司），BUCHIR-200 旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司），KQ-100E 型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司），SHZ-DⅢ水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司），DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司），BrukerAVⅢ-500 型核磁共振波谱仪（美国Bruker公司），安捷伦6520 系列高分辨Q-TOF-ESI-MS（安捷伦科技有限公司）。

柱层析用硅胶（青岛海洋化工厂）；高效薄层层析板（默克）；化学合成试剂主要为优级纯，少量分析纯，均购买于上海晶纯实业有限公司（阿拉丁）和上海泰坦科技股份有限公司（阿达玛斯）。

1.2 方法

1.2.1 7-氨基岩白菜素的制备取50 mg 已制备好的7-对苯砷酸偶氮岩白菜素[11]置于50 mL 双口圆底烧瓶，加入5 mL 甲醇超声溶解，溶解完全后常温搅拌条件下加入100 g 锌粉，通入惰性气体氩气保护反应进行，另外称取150 mg 甲酸铵，加入5 mL 甲醇超声溶解完全后在真空条件下将甲酸铵溶液用10 mL 注射器吸取甲酸铵溶液注射于双口圆底烧瓶中反应，每隔0.5 h 用碘显色和薄层色谱（TLC）检查反应终点。2 h 反应完全后常温过滤，减压蒸馏滤液，经300～400 目硅胶柱色谱分离，使用氯仿:乙醇（17:3）进行洗脱，得到化合物1，采用核磁共振对其进行结构鉴定。化合物1 反应途径见图1。

图1 7-氨基岩白菜素的合成Fig.1 Preparation of 7-amino bergenin

1.2.2 镇咳活性评价取小鼠32 只，雌雄各半，随机分成4 组（空白组、模型组、供试药组、和岩白菜素组），每组8 只。实验前小鼠禁食不禁水12 h，各组均灌胃给药（岩白菜素剂量100 mg/kg），给药1 h 后，将小鼠置于倒置的500 mL烧杯内，用1 mL 注射器吸取浓氨水（25%～28%）0.15 mL 注入烧杯内放的棉球中观察小鼠出现咳嗽的时间（咳嗽潜伏期）和3min 内咳嗽次数（以小鼠腹肌收缩或缩胸，同时张嘴为咳嗽指标）。

1.2.3 祛痰活性评价取小鼠36 只，雌雄各半，随机分成3 组（生理盐水组，岩白菜素组，供试药组），每组12 只。实验前禁食不禁水12 h。分别灌胃给予药物组和岩白菜素（100 mg/kg）及生理盐水（1 mL/200 g）。给药后0.5 h，腹腔注射0.5%酚红溶液0.5 mL，30 min 后处死小鼠（尽量不损伤气管），仰位固定于手术板上，剪开颈正中皮肤，分离气管，在气管下穿一丝线，用8 号针头于喉头下插入气管内0.3 cm，丝线结扎固定，用1 mL 注射器吸取0.5 mL 的5%NaHCO3溶液来回灌洗呼吸道3 次，将灌洗液注入一比色管中，重新吸取5%NaHCO3溶液0.5 mL 如上再灌洗3 次，再同样灌洗3 次，如此共抽洗9 次，合并洗出液，离心10 min，取上清液，用分光光度计在波长546 nm 处测OD 值，从标准曲线上计算出酚红排出量（μg/mL），并与对照组相比。

酚红标准曲线的测定:分别配制标准浓度酚红溶液，以分光光度计测定吸光度（A），以A 对酚红含量C 回归，算得回归方程。

1.3 统计学处理

实验结果均使用SPSS 采用单因素方差分析进行处理，结果以（）表示，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 波谱数据

化合物1，淡黄色油状物，分子式为C14H17NO9。1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：4.97（1H，d，H-10b）; 4.86 （1H，m，H-4a）; 4.03（1H，m，H-4）; 3.98 （1H，m，H-2）; 3.79（1H，m，H-9-OCH3）,3.67 （1H，m，H-11）;3.40 （1H，m，H-3）; 13C-NMR（CD3OD，125MHz）δ：80.69 （C-2），74.86 （C-3），75.81（C-4），167.92 （C-6），139.09 （C-7），112.25（C-8），142.07（C-9），139.80 （C-10），62.73（C-11），82.87 （C-4a），98.89 （C-6a），111.01（C-10a），60.97 （9-OCH3）71.88 （C-10b），ESI-MS （m/z）:344.10 [M+H]+。经分析确定为7-氨基岩白菜素。

2.2 镇咳活性

各组小鼠咳嗽潜伏期比较差异无统计学意义（P>0.05）；与空白组相比，模型组3 min 内的咳嗽次数显著增加，显示造模成功。与模型组相比，供试药组小鼠3 min 内咳嗽次数显著降低（P<0.01）；同时，与岩白菜素组相比，供试药组小鼠3min 内咳嗽次数降低（P<0.01），以上结果表明，7-氨基岩白菜素具有镇咳活性，见表1。

2.3 祛痰活性

祛痰活性的比较显示，施加7-氨基岩白菜素后的祛痰活性均显著优于生理盐水组（P<0.01）；另外，与岩白菜素组相比，供试药组小鼠气管酚红排出量同样明显增加（P< 0.05），以上结果表明，岩7-氨基岩白菜素具有显著祛痰活性，见表2。

表1 7-氨基岩白菜素对小鼠的镇咳活性比较（）Tab.1 A comparison of antitussive effect of 7-amino bergenin on mice （）

与模型组比较，**P<0.01，与岩白菜素组比较，##P<0.01。

表2 7-氨基岩白菜素对小鼠的祛痰活性比较（）Tab.2 A comparison of expectorant effect of 7-amino bergenin on mice （）

与生理盐水组比较，**P<0.01，与岩白菜素组比较，#P<0.05。

3 讨论

利用偶氮还原方法对岩白菜素偶氮衍生物进行还原，使氮-氮键断裂而生成氨基岩白菜素，这种方法不仅具有步骤少、反应条件温和的优点，而且氨基的引入也可能增加岩白菜素的溶解度，从而提高生物利用度、增强其药理活性。

在设计还原岩白菜素偶氮衍生物中，根据岩白菜素偶氮衍生物及实验室的条件笔者尝试使用水合肼（N2H4·H2O）做供氢体，钯碳（Pb/C）为催化剂在80℃下进行还原，但该还原反应速度极慢，产率极低；也尝试使用硫代硫酸钠（Na2S2O3）在稀NaOH（2 mol/L）条件下进行还原，该还原反应速度较快，但反应溶液放置后接触空气后变色氧化，最终我们采取了以甲酸铵作为供氢体、锌粉（Zn）提供电子在甲醇中还原岩白菜素偶氮衍生物，该方法操作方便、简单、原子经济性高且反应基团专一。

研究证实岩白菜素具有镇咳祛痰的药理作用[12-14]，研究大多利用氨水引咳法和气管酚红排泌法来观察岩白菜素对小鼠的镇咳祛痰活性[15-16]，方法较为成熟，且容易操作。通过氨基的引入所得到的衍生物7-氨基岩白菜素，具有显著的镇咳祛痰活性。与岩白菜组相比，无论是镇咳活性或者是祛痰活性，供试药组均显示出较好活性，这为岩白菜素的镇咳祛痰活性研究提供了的新的研究基础，也为后续的岩白菜素结构修饰提供了新的研究方向。