四川不同种源银杏种子表型性状与叶片黄酮含量的比较研究

刘芙蓉，杨马进，罗建勋，王海峰

(1.四川省林业科学研究院，四川 成都 610081；2.四川省植物工程研究院，四川 成都 611735)

银杏GinkgobilobaL.属银杏科Ginkgoaceae银杏属Ginkgo，是世界上最古老的孑遗植物之一，被称为裸子植物的“活化石”，是集经济、观赏和生态效益价值于一体的多功能经济树种[1-4]。按用途可将其分为观赏型银杏、果用型银杏、雄株品种、材用型银杏和叶用型银杏等类型，其中观赏型银杏、果用型银杏和叶用型银杏的栽培比较广泛，而雄株品种、材用型银杏的培育相对较少[5-7]。目前，银杏叶片和种仁的研究主要集中在化学成分、药理作用及其临床应用等相关领域[8-11]。银杏叶片主要含黄酮类和萜类内酯类等药用成分，具有活血化瘀、通络止痛、敛肺平喘等功效，对心脑血管系统疾病的治疗具有重要作用[12-14]；银杏种仁主要含白果酸、白果醇、白果粉、鞣质、糖类等药用成分，除具有较高食用价值外，还具有镇咳平喘、抗过敏、延缓衰老、抑菌等药用功效[15-16]。

近年来，我国银杏开发和利用越来越受到重视。江苏、广西、山东、浙江等我国银杏主产区省份在银杏资源利用、产品开发、旅游发展等一系列相关产业领域快速发展，并形成一定规模。四川地形多样、气候适宜，境内银杏古树种质资源较为丰富[17]。目前南充、巴中、广安、达州等地区叶用银杏产业发展较为迅速，但整体叶用银杏优良种源的区划和优良种源的筛选研究尚属空白，对不同种源叶用银杏产量及品质的综合评价研究亦未见报道。因此，本研究以四川银杏主产区10个种源地收集的银杏古树种子为试验材料，通过测定不同种源种子表型性状及一年生实生苗叶片总黄酮醇苷含量，分析探讨四川不同种源银杏种质资源性状表现差异性，以期为四川叶用银杏优良种源区划和筛选优异种质提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本文以2017年秋季在四川银杏主产区内10个种源地收集的银杏古树种子为试验材料，测定各种源种子的表型性状和一年生实生苗叶片总黄酮醇苷含量。10处种源收集地情况见表1。

表1 银杏种子种源收集地概况Tab.1 Collecting sites of Ginkgo biloba L. seeds序号种源经度(E)纬度(N)海拔/m年均温/℃年降雨量/mm土壤类型1巴中通江县107°38'28″32°15'53″80716.71 399壤土2雅安芦山县103°06'51″30°29'23″1 18914.31 360壤土3德阳什邡市104°10'07″31°08'25″52716.21 320壤土4都江堰市103°37'11″30°59'12″71015.21 244壤土5达州万源市108°01'48″32°04'59″1 04414.71 195壤土6崇州市103°40'06″30°37'58″53615.91 012壤土7广元利州区105°50'08″32°26'26″48914.9980壤土8成都锦江区104°04'03″30°39'23″60216.2960壤土9绵阳平武县104°49'57″32°12'11″70514.7867壤土10阿坝州茂县103°51'10″31°41'06″1 74211.2486壤土

1.2 试验方法

1.2.1 种子表型性状测定 于2017年秋季陆续收集了四川省10个种源的银杏古树种子，测定种子三径(横径、纵径、侧径)和百粒重等表型指标，每个种源三径各测定种子数量30粒，重复5次。其中三径采用电子游标卡尺测定，精确到小数点后2位；百粒重选用电子天平测定，精确到小数点后2位。

1.2.2 叶片总黄酮醇苷含量测定 银杏叶片内含物中总黄酮醇苷是反映叶片药用有效成分的重要指标之一[18]，但银杏叶片黄酮含量随树龄的变化较大，对种源收集地植株成熟叶片进行成分对比分析不能准确反映各种源银杏叶片总黄酮醇苷含量的差异。因此，2018年3月，对10个种源收集的种子在四川都江堰市安龙镇同一地点进行育苗，采用相同田间管理方法，于2018年8月采集叶片样品进行检测，参照2015版《中华人民共和国药典》，采用高效液相色谱法(HPLC)[19-20]，用各苷元对照品外标测定并分别计算出样品槲皮素、山奈素和异鼠李素等黄酮苷元含量，最终按系数计算出总黄酮醇苷含量，精确到小数点后2位，重复3次。

1.2.3 数据处理 运用Excel 2019进行数据整理，利用DPS 7.05软件进行数据方差分析，最后采用Origin Pro 8.5软件制作图表。

2 结果与分析

2.1 不同种源银杏种子表型性状对比分析

2.1.1 不同种源银杏种子三径对比分析 对10个种源的银杏种子横径、纵径和侧径进行方差分析，结果见表2、图1。

表2 不同种源银杏种子三径性状方差分析Tab.2 Variance analysis of 3 diameters of Ginkgo biloba L. seeds from different provenances指标变异来源平方和自由度均 方F 值P值处理间326.29936.2543.53**0.000 1横径处理内241.552900.83总变异567.84299处理间1 330.379147.8253.77**0.000 1纵径处理内797.302902.75总变异2 127.67299处理间135.27915.0328.28**0.000 1侧径处理内154.152900.53总变异289.42299 注:表中“**”表示在1%水平上极显著。下同。

由表2可知，横径、纵径和侧径的差异均达到极显著水平(P<0.01)，表明不同环境条件下各种源种子外观大小差异明显。对比分析结果表明，10个种源银杏种子横径均值为15.22 mm(变幅为13.27～17.52 mm)，纵径均值为20.96 mm(变幅为17.53～25.61 mm)，侧径均值为12.58 mm(变幅为11.73～13.96 mm)；其中，巴中通江县种子三径平均值均最大，显著高于其它地区，该种源地年均温及年降雨量高于其它种源，表明高温高湿环境可能有利于银杏种子发育饱满；而成都锦江区种子横径最小，为13.27 mm；绵阳平武县种子纵径最小，为17.53 mm；都江堰市种子侧径最小，为11.73mm。该3个种源均位于川西北地区，表明川西北部气候环境下银杏种子较其它地区偏小。

2.1.2 不同种源银杏种子百粒重对比分析 不同种源银杏种子百粒重方差分析结果见表3，性状测定结果对比见表4。

表3 不同种源银杏种子百粒重方差分析Tab.3 ANOVA of hundred-grain weight of Ginkgo biloba L. seeds from different provenances变异来源平方和自由度均 方F 值P值处理间97 700.24910 855.58619.54**0.000 1处理内700.884017.52总变异98 401.1249

表4 不同种源银杏种子百粒重测定Tab.4 Determination of hundred-grain weight of Ginkgo biloba L. seeds from different provenanceg序号种源百粒重均值变幅1通江县275.52±5.23 aA267.86～280.482芦山县143.14±1.95 gF140.80～145.523什邡市188.31±3.78 cC183.58～193.454都江堰市156.60±3.10 eE152.03～160.015万源市206.76±2.96 bB203.26～210.976崇州市202.36±3.58 bB198.31～207.897利州区177.80±4.25 dD172.58～184.368锦江区121.15±7.90 hG110.68～130.919平武县123.34±3.65 hG119.10～127.5410茂县151.05±2.17 fE148.60～154.28 注:表中数值后面小写英文字母为5%显著水平字母标识,大写英文字母为1%极显著水平字母标识。

由表3可知，10个种源银杏种子百粒重差异均达到极显著水平(P<0.01)，表明不同环境条件下，各种源种子百粒重差别明显。由表4可知，各种源银杏种子百粒重均值为174.60 g(变幅为121.15～275.52 g)，最大值与最小值差异达154.37 g，其中巴中通江县种子平均百粒重为275.52 g，显著高于其它地区，而成都锦江区和绵阳平武县种子百粒重较低，为121.15 g和123.34g，显著低于其它地区，表明高温高湿环境条件下银杏种子百粒重较大，而川西北部种源地区环境条件下银杏种子百粒重整体较低。

2.2 不同种源银杏叶片总黄酮醇苷含量对比分析

对10个不同种源银杏一年生实生苗叶片总黄酮醇苷含量进行测定，结果见图2。结果表明，在同一环境条件下，10个不同种源银杏种子一年生实生苗叶片槲皮素、山奈素、异鼠李素含量都表现出一定程度的差异，总黄酮醇苷含量除广元利州区种源外，其它9个种源较为接近。其中，从槲皮素含量来看，均值为0.84%(变幅为0.51%～1.27%)，其中广元利州区种源含量最高，雅安芦山县种源次之，都江堰市种源最低；从山奈素含量来看，均值为0.73%(变幅为0.47%～0.97%)，广元利州区种源含量依然最高，绵阳平武县种源次之；从异鼠李素含量来看均值为0.04%(变幅为0.02%～0.05%)，崇州市种源含量最高，万源市种源次之；从总黄酮醇苷含量来看，均值为1.61%(变幅为1.24%～2.28%)，广元利州区种源含量最高，成都锦江区种源次之，都江堰市种源含量最低。

3 结论与讨论

3.1 四川省不同种源银杏表型性状和总黄酮含量差异

四川银杏主产区内10个不同种源银杏种子在三径及百粒重表型性状指标上差异均达到极显著水平(P<0.01)，其一年生实生苗叶片总黄酮醇苷含量亦存在差异，表明受自然环境条件各因素的影响，四川银杏主产区内不同种源间银杏种子表型性状具有明显差异，银杏叶片内总黄酮醇苷有效药用成分存在遗传变异，说明四川省开展优良核用或叶用银杏种质资源筛选具有可行性。整体而言，川东北部地区的银杏种源在种子大小、百粒重方面表现优于其它种源，而成都平原地区及川西北部地区种源表现则比其它种源要差。就银杏一年生实生苗总黄酮含量而言，相同环境条件下，除广元利州区种源外，各种源差异不大。

3.2 四川省优良银杏种源资源选择

对银杏种子性状的变异及其性状间的相关性了解有助于确定有效选择策略，有利于筛选出种子性状表现优异的母树用于生产和育种创新，以获得更大附加值[21]。朱益川等[22]、莫昭展等[23]通过对银杏种子性状变异的相关性研究发现，银杏种子性状变异以单核重的变异幅度最大，而银杏单核重又与其种子重量有关[24]。10个种源中，川东北地区的巴中通江县种源种子表型性状各项指标均最高，成都锦江区种源及绵阳平武县种源整体指标表现最差。因此，从商品角度分析，以生产种子为主要栽培目的，则属通江县种源表现最为优异，为优良银杏种源。

郁万文等[18]通过对不同银杏无性系叶药用成分差异分析，发现其多数无性系叶中黄酮含量不到1.50%，而此次10个参试种源中广元利州区种源一年生实生苗叶片总黄酮含量最高，含量高达2.28%，这可能与其自然地理环境因素息息相关，其环境条件下遗传物质有利于黄酮类化合物的积累[25]。在实际生产中，叶用银杏优良种源选择常以提高银杏叶片产量、叶片药用成分含量为遗传改良目标进行多性状综合评价与筛选，其中叶片中药用有效成分的含量是其首要考虑因素，其次为产量性状[26]。因此，四川省10个银杏种源中，以总黄酮醇苷含量为选择目标的叶用型银杏种源以广元利州区种源最佳，成都锦江区种源次之。对优良种源，我们可通过嫁接、扦插等无性繁殖方式扩繁，进一步建立银杏采叶园，促进产业发展。