肉鸡与蛋鸡H5、H7、H9亚型禽流感病毒抗体水平调查

李家凯 郭康康 刘丽娜

摘要：为了解养殖场家禽中H5、H7、H9亚型禽流感病毒抗体水平，通过血清学调查，应用血凝抑制试验（HI）的方法，对四川内江、山东济南、河南鹤壁、江苏扬州4个定点实验观测站负责的养殖场的鸡血液样本进行禽流感病毒抗体分析，其中包含2个肉鸡场和3个蛋鸡场。研究发现蛋鸡场通常免疫了H5、H7、H9（或H5与H9）亚型禽流感疫苗，而肉鸡场只免疫了H9亚型禽流感疫苗;蛋鸡场和肉鸡场都存在免疫禽流感疫苗后抗体水平低和无抗体产生的情况，从而导致免疫不合格或免疫失败。以上结果表明，应加强家禽养殖场对不同亚型禽流感疫苗的免疫以及免疫后的禽流感病毒抗体水平监测，以防免疫失败，从而预防禽流感的发生和流行。

关键词：肉鸡与蛋鸡;H5、H7、H9亚型禽流感疫苗;抗体水平;免疫合格率

Abstract： In order to understand the immune antibody level of H5， H7 and H9 subtypes avian influenza virus in poultry， the blood samples of four experimental observation stations in Neijiang city of  Sichuan province， Jinan city of Shandong province， Hebi city of Henan province and Yangzhou city of Jiangsu province were analyzed by serological investigation and hemagglutination inhibition test（HI），including two broiler farms and three layer farms. The research found that layers were immunized with H5， H7， H9（or H5 and H9） subtypes avian influenza vaccines， while broilers were only immunized with H9 subtype avian influenza vaccine. The layer farms and broilers farms had low antibody production after the immunization of avian influenza vaccine， leading to unqualified or immune failure. It is suggested that the immunization different subtypes of avian influenza vaccine and the monitoring of avian influenza antibody levels after immunization should be strengthened to prevent the occurence and prevalence of avian influenza.

Key words： broilers and laying hens; H5， H7， H9 subtypes of avian influenza vaccine; antibody level; qualified rate of immunity

1994年，张泽纪等[1]首次从中国广东某鸡场发病鸡体内分离到H9N2亚型病毒。H9N2亚型禽流感病毒灭活苗（以A/Chicken/Shandong/6/1996为疫苗株）自1999年首次在中国被批准使用[2]，此后H9N2单价苗和联苗陆续上市，为中国防控H9N2禽流感的流行发挥了重要作用。但近年来， H9N2禽流感病毒经常从已免疫的鸡群中分离到， 这说明H9N2抗原性已在多种因素的作用下发生了改变， 导致现有的疫苗效力降低甚至失效[3]。因此有必要对不同地区禽群中的H9N2的流行与变异情况进行实时监测， 一方面為生产企业疫苗种毒的更新提供依据， 另一方面也可以帮助本地区的养殖者有针对性地选择抗原性匹配的疫苗[4]。

1996年，中国首次从广东省的鹅中分离到H5N1亚型高致病性禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）A/goose/Guangdong/1/96。2003年以来特别是2004年， 中国暴发了多起H5亚型高致病性禽流感疫情，给中国养禽业造成了巨大损失。2005年，中国开始实施H5亚型禽流感的全面免疫政策[5]。从2006年最初推出的Re-1疫苗和Re-4疫苗，到2017年H5 亚型流感疫苗已更新到Re-10[6， 7]。

2013年后H7N9流感病毒在中国活禽交易市场、农贸市场以及禽群中的感染范围不断扩大[8]。多家兽医机构监测结果均表明， 中国H7N9亚型流感病毒的养殖场阳性率和个体阳性率在总体上均呈现逐年上升趋势， 对家禽养殖业和公共卫生安全产生严重威胁[9]。中国于2017年开始使用重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗（H5N1Re-8株+H7N9H7-Re1株）， 对全国家禽（包括水禽）实施免疫。在2018年底更新为“重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11株+Re-12株， H7N9 H7-Re2株）”等新疫苗，以满足高致病性禽流感防控的急需[10]。为此，为了解家禽养殖场中H5、H7、H9亚型禽流感病毒的免疫抗体水平，本研究对四川内江、山东济南、河南鹤壁、江苏扬州4个定点实验观测站负责的5家禽养殖场的鸡血液样本进行流感抗体检测，分析其禽流感抗体水平及免疫合格率，以期为预防禽流感的发生提供参考。

1 材料与方法

1.1 诊断试剂和红细胞的制备

禽流感病毒H5、H7、H9亚型血凝抑制试验诊断抗原和禽流感 H5、H7、H9亚型阴、阳性血清购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。红细胞采自实验室饲养的未经疫苗免疫的健康鸡，并按照常规程序制备1%的红细胞悬液。

1.2 样品采集

2019年4月对内江、济南、扬州、鹤壁4个地方定点观测站的鸡群采集血清样本，共采集300份样品。每只鸡通过翅静脉采血1～2 mL，置于2 mL EP管中。之后4 000 r/min 离心5 min，离心后上层清亮液体即为血清，小心吸取放入1.5 mL EP管中，最后置于0～4 ℃冰箱中保存备用。

1.3 血凝抑制试验测定样品的抗体效价

血凝抑制实验：血凝—血凝抑制试验（HA-HI试验，微量法）按照高致病性禽流感诊断技术和高致病性禽流感免疫技术标准进行[11]。HI效价测定按高致病性禽流感诊断技术（GB/T 18936—2003）进行判定，HI抗体水平按照农业部行业标准NY/T 769—2004进行判定，即HI抗体≥4log2为免疫合格，抗体合格率70%以上为群体免疫合格。

2 结果与分析

2.1 鸡群禽流感疫苗免疫情况

本研究对4个实验站的5个鸡场的鸡的品种、日龄、采集样本数以及禽流感疫苗免疫情况进行了统计，从表1可知，采集血清样本主要来源于肉鸡和蛋鸡，其中肉鸡主要免疫H9亚型禽流感疫苗，蛋鸡则免疫H5、H7、H9（或H5与H9）亚型流感疫苗。

2.2 鸡群禽流感抗体水平及免疫合格率

本研究对4个实验站5个鸡场鸡的H5、H7、H9抗体效价以及免疫合格率进行了统计，具体结果见表2和表3。从表2和表3可以看出，四川内江观测站60份样本H9抗体平均效价5.6log2，免疫合格率为82%，H7和H5因其没有免疫，抗体效价和免疫合格率均为0;山东济南观测站60份样本H5、H7、H9抗体平均效价分别为6.43log2、8log2、7.95log2， 其H5、H7、H9免疫合格率均为100%;河南鹤壁观测站100份样品未测出H9、H7、H5抗体， H9疫苗免疫合格率为0，H7和H5因其没有免疫，抗体效价和免疫合格率均为0;江苏扬州观测站一场40份样本H5、H7、H9抗体平均效价分别为0、0、7.9log2，H5疫苗免疫合格率为0，H9疫苗免疫合格率100%，H7因其没有免疫，抗体效价和免疫合格率均为0; 江苏扬州观测站二场40份样本H5、H7、H9抗体平均效价分别为3.55log2、7.93log2、7.98log，H5免疫合格率为50%，H7、H9免疫合格率均为100%。

3 小结与讨论

3.1 免疫禽流感疫苗无抗体产生

由于肉鸡和蛋鸡的生产周期不同，免疫疫苗种类也不尽相同，本研究调查发现肉鸡只免疫H9亚型禽流感疫苗，而蛋鸡则免疫H5、H7、H9（或H9与H5）亚型禽流感疫苗。四川内江观测站和河南鹤壁观测站肉鸡场中，四川内江站H9抗体群体免疫合格，而河南鹤壁在注射了H9疫苗之后仍未产生抗体效价;江苏扬州一场蛋鸡免疫H5疫苗之后仍未产生H5抗体效价。分析可能是以下几个方面的原因：各观测站免疫疫苗的生产厂家不同，这可能是导致各观测站鸡群的禽流感病毒抗体效价和免疫合格率不同的一个原因;其次每个厂的饲养管理、饲养环境和饲养人员的水平也不尽相同，一些管理和操作上的不规范也是可能导致免疫失败的重要原因;最后还可能是鸡群中本身存在一些免疫抑制病，在免疫后产生了免疫抑制，从而可能导致鸡群无相应抗体产生。

3.2 免疫禽流感疫苗后禽流感病毒抗体水平和免疫合格率不同

山东济南和江苏扬州蛋鸡场的H9禽流感抗体水平和免疫合格率都高于四川内江和河南鹤壁肉鸡场。对现在蛋鸡和肉鸡的免疫程序进行分析，蛋鸡和肉鸡禽流感疫苗一般采用以下免疫程序：蛋鸡开产前接种4次，15日龄首免，35日龄第2次免疫，80日龄第3次免疫，130日龄第4次免疫， 开产后每3～4个月加强免疫1次;肉鸡在2周龄时进行1次免疫。从免疫程序可知蛋鸡的免疫次数高于肉鸡，因此可能导致蛋鸡场抗体水平和免疫合格率优于肉鸡场。

通过本次鸡群禽流感病毒抗体水平调查发现，肉鸡只免疫了H9亚型禽流感疫苗，未免疫H7与H5亚型禽流感疫苗，因此肉鸡无法预防H5与H7亚型禽流感的发生，因此建议肉鸡场应该考虑增加H7与H5亚型禽流感疫苗免疫;其次本研究还发现养殖场免疫禽流感疫苗后并没有产生相应的禽流感抗体或者产生相应抗体后仍然达不到合格标准，建议养殖场也要加强鸡群免疫后禽流感抗体水平监测，以防免疫失败，从而预防禽流感的发生和流行。

参考文献：

[1] 张泽纪，陈伯伦，陈伟斌. 禽流感研究Ⅱ. 禽流感的发生情况和血清学调查[J]. 中国兽医杂志，1994（10）：6-7.

[2] LI C L， YU K Z， TIAN G B， et al. Evolution of H9N2 influenza viruses from domestic poultry in Mainland China[J].  Virology， 2005， 340：70-83.

[3] 童海兵，张小荣，吴艳涛，等. H9N2亚型禽流感灭活疫苗的免疫效果评价[J]. 中国家禽，2010（20）：22-25.

[4] 丛彦龙，钟 颖，孙艺学，等. H9N2亚型禽流感病毒流行病学及其疫苗的研究进展[J]. 中国兽医学报，2017（2）：386-392.

[5] 蒋文明，李金平，侯广宇，等. H5亚型高致病性禽流感病毒抗原性变异分析[J]. 中国动物检疫，2016（9）：27-32.

[6] ZHAO K K， GU M， ZHONG L， et al. Characterization of three H5N5 and one H5N8 highly pathogenic avian influenza viruses in China[J].  Veterinary microbiology， 2013，163（3-4）.

[7] World Health Organization/World Organisation for Animal Health/Food and Agriculture Organization （WHO/OIE/FAO）H5N1 Evolution Working Group.Revised and pdated nomenclature for highly pathogenic avian influenza A（H5N1） viruses[J]. Influenza other respir viruses，2014，8（3）：384-388.

[8] WANG D， YANG L， GAO R， et al. Genetic tuning of the novel avian influenza A （H7N9） virus during interspecies transmission， China， 2013[J]. Euro surveillance， 2014， 19（25）：20836.

[9] 劉玉良，刘文丽，高晓艺，等. H7N9亚型流感流行病学特征及防控建议[J]. 中国家禽，2017（19）：1-5.

[10] 李永红. 2019年春防高致病性禽流感免疫要更换新疫苗[J]. 北方牧业，2019（04）：15.

[11] GB/T 18936—2003， 高致病性禽流感诊断技术[S].