亚麻籽饼粕中木酚素的微波辅助提取工艺及抗氧化活性研究

（吉林农业科技学院食品工程学院，吉林吉林132101）

亚麻是亚麻科、亚麻属一年生或多年生的十大油 料作物之一，也叫胡麻[1]，亚麻籽饼粕是榨油后剩余的副产物，传统的亚麻籽只限于榨油，剩余的副产物只用作动物饲料或废物处理，没有得到充分的开发和利用。亚麻籽饼粕中含有的营养成分包括亚麻蛋白、膳食纤维和木酚素等[2-3]。木酚素类物质主要包括开环异落叶松树脂酚（secoisolariciresinol，SECO）和其糖苷开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷（secoisolariciresinol diglucoside，SDG）等。其中SECO占到木酚素的62%，但通常以SDG这种最主要的活性成分形式存在[4-5]。SDG是一种植物激素，与人体的雌激素十分相似，具有抑制人体乳癌细胞生长、预防前列腺癌、经期综合症、骨质疏松等作用[6-7]。亚麻籽饼粕中高纯度的木酚素具有抗氧化性和很好的药用前景，其活性和药性显著主要表现在对糖尿病、冠心病、胃肠肿瘤等。木酚素也可以作为天然抗氧化剂应用于食品中[8]，开发利用亚麻籽饼粕中的木酚素具有广阔的市场前景。

亚麻籽饼粕中存在的这种活性成分SDG是与一些不确定成分结合成为络合物，传统的超临界流体萃取、有机溶剂、酶法、超声波辅助提取[9]等却忽略这一点，造成提取不充分或得率低。微波辅助提取技术具有操作简单、溶剂消耗量低、节省时间、效率高等优点[10-11]，可以解决传统方法存在的问题，因此被广泛应用于天然植物活性成分的提取工艺。本试验应用响应面分析法，对亚麻籽饼粕中的木酚素进行微波辅助提取的工艺进行优化，从而得到最佳的提取工艺，并研究它的抗氧化性，为进一步开发天然抗氧化剂寻找最佳技术依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

亚麻籽饼粕：内蒙古蒙谷香生物科技有限公司；SECO标品：上海江莱生物科技有限公司，纯度98%以上；正己烷、无水乙醇、氢氧化钠、盐酸、醋酸纤维素膜、正丁醇、甲醇、磷钼酸、Na2HPO4、NaH2PO4、H2O2、VC、Tris-HCl、邻苯三酚、DPPH标准品：西亚化学科技（山东）有限公司。

1.2 仪器

多功能高速粉碎机（HR-03）：上海哈瑞斯电器有限公司；微波合成反应仪（MCR-3）：巩义市予华仪器有限公司；紫外可见分光光度计（UV-1700）：山海美析仪器有限公司；台式离心机（KH19A）：湖南凯达有限公司；旋转蒸发仪（RE-52A）：上海亚荣生化仪器厂；恒温水浴锅（HHS-6）：成都臻通贸易有限公司。

2 试验方法

2.1 工艺流程

亚麻籽饼粕→粉碎→过筛→脱脂→离心→烘干→加入提取剂→预浸搅拌→微波辅助提取→离心→碱解→调pH值→微滤→萃取→减压浓缩→复溶→纯化→测定

2.2 木酚素的标准曲线的绘制

采用磷钼酸显色法测定[12]。开环异落叶松树脂酚标准品用甲醇将其溶解，配成浓度为11.65 μg/mL的标准液，准确吸取标准液 0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL至20mL的刻度试管中，分别加入3倍体积的5%磷钼酸乙醇溶液，80℃水浴加热，除去溶剂，升温至100℃，再加热15 min，冷水冷却，依次加入蒸馏水10 mL，上下振摇使其完全溶解。用紫外可见分光光度计测定，确定最大吸收波长，在最大吸收波长下测定各处理的吸光度值，以浓度对吸光度值做标准曲线。

2.3 亚麻籽饼粕木酚素的提取

亚麻籽饼粕粉碎，过100目筛，取100 g加入1∶5（g/mL）的正己烷于 24℃下搅拌，脱脂 15 h，4 000 r/min离心20 min，弃去上清液，脱脂粉末移入平皿中，入鼓风干燥箱中干燥，40℃60 min。取亚麻籽饼粕脱脂粉5 g按一定比例加入提取剂乙醇，注意溶液不要超过500 mL，搅拌，调节微波功率和时间进行微波萃取，测量醇提液的体积，4 000 r/min离心20 min，配制1mol/LNaOH溶液进行碱解，使醇提液中NaOH的浓度调至0.25 mol/L（3份醇提液+1份NaOH），1 mol/L HCl调节pH值为4.0，用0.45 μm的醋酸纤维素膜进行微滤[13-14]。加入水饱和的正丁醇溶液萃取3次[15]，合并正丁醇相，减压浓缩除去正丁醇。根据以下公式计算得率。

式中：Y为亚麻籽饼粕木酚素得率，mg/g；Ms为提取液中亚麻籽饼粕木酚素质量，mg；Mc为脱脂亚麻籽饼粕的质量，g。

2.4 单因素试验设计

2.4.1 乙醇浓度对木酚素得率的影响

固定微波时间为2 min，微波功率为300W，料液比为1∶20（g/mL），分别设置乙醇浓度为30%、40%、50%、60%及70%，以亚麻籽饼粕中木酚素得率为指标，按照上述操作方法，确定最适乙醇浓度。

2.4.2 微波时间对木酚素得率的影响

固定乙醇浓度，微波功率为300 W，料液比为1 ∶20（g/mL），分别设置微波时间为 1、1.5、2、2.5 min 及3 min，以亚麻籽饼粕中木酚素得率为指标，按照上述操作方法，确定微波的最佳时间。

2.4.3 微波功率对木酚素得率的影响

固定乙醇浓度、微波时间，料液比为 1∶20（g/mL），分别设置微波功率为200、250、300、350 W及400 W，以亚麻籽饼粕中木酚素得率为指标，按照上述操作方法，确定微波的最佳功率。

2.4.4 料液比对木酚素得率的影响

固定乙醇浓度、微波时间、微波功率，分别设置料液比为 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）[16]，以亚麻籽饼粕中木酚素得率为指标，按照上述操作方法，确定最适料液比。

2.5 响应面试验设计

根据单因素试验来设计响应面试验，确定四因素（乙醇浓度A、微波时间B、微波功率C、料液比D）三水平，进行响应面交互作用分析。研究不同因素对亚麻籽饼粕中木酚素得率的影响，确定最佳工艺条件和最大得率。

2.6 亚麻籽饼粕木酚素提取的抗氧化试验设计

2.6.1 DPPH自由基清除率的测定

按照文献[17-18]方法进一步改进。取250mgDPPH固体用乙醇溶解，配成浓度为250 mg/L溶液备用。取20 mL比色管6支，第1支加入250 mg/L DPPH乙醇溶液4 mL和95%乙醇1.0 mL，摇匀，参比溶液用95%乙醇，波长调至515 nm，测定吸光度值记做A0，其余5支比色管分别加入95%乙醇4 mL和不同浓度（50、100、150、200、250 mg/L）的待测试样 1.0 mL，测定吸光度值记做Ar，最后取比色管加入250 mg/L DPPH乙醇溶液4.0 mL和1.0 mL待测试样，测定吸光度值，记做AS。VC溶液作为其抗氧化性的对照试验。清除率计算见式（1），根据SPSS Statistics 26软件计算IC50值，值越小，清除自由基能力越强，抗氧化能力就越强。

式中：AS为DPPH乙醇溶液+待测试样的吸光度；Ar为95%乙醇溶液+待测试样的吸光度；A0为DPPH乙醇溶液+95%乙醇溶液的吸光度。

2.6.2 超氧阴离子自由基清除率的测定

采用邻苯三酚氧化法[19]进行测定：在20 mL比色管中分别加入Tris-HCl缓冲溶液（pH 8.2）3 mL，和不同浓度（0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L 及 1.0 mg/L）的样品液1 mL，并置于恒温水浴锅中加热，25℃加热20 min，比色管中再加入7.0 mol/L的邻苯三酚0.3 mL再反应4 min，加入10 mol/L的HCl 1 mL使反应结束，420 nm处，测定吸光度值A，按照上述操作方法，不加样品进行测定吸光度值A0，测定样品本身的吸光度值记做A1。VC溶液作对照，清除率计算见式（2），SPSS Statistics 26软件计算IC50值。

式中：A0为空白对照液的吸光度；A为样品组的吸光度；A1为样品溶液本身的吸光度。

2.6.3 ·OH清除率的测定

对照文献[20]的方法加以改进。配制0.2 mol/L pH 4的磷酸盐缓冲溶液100 mL，取10.21 mL 30%的H2O2加入缓冲盐溶液89.79 mL，配成含有磷酸盐缓冲溶液的10 mol/L的H2O2溶液。取5 mL置于20 mL比色管中，加入样品液5 mL，样品液配成不同浓度50、100、150、200、250 mg/L。混合均匀，波长调至 230 nm处，测定吸光度值A1。另取两支比色管，一支不加样品液，另一支不加H2O2，波长相同下测定吸光度值记做A0和A2，各管用水定容。VC溶液作对照，清除率计算见式（3），SPSS Statistics 26软件计算IC50值。

式中：A0为不加样品液的H2O2溶液的吸光度；A1为样品液的吸光度；A2为不加H2O2溶液的样品液的吸光度。

3 结果与分析

3.1 木酚素的标准曲线

磷钼酸显色法测定亚麻籽饼粕中木酚素的标准曲线见图1。

图1 磷钼酸显色法测定亚麻籽饼粕中木酚素的标准曲线Fig.1 Standard curve for determination of flaxseed cake lignan

亚麻籽饼粕中木酚素的标准曲线方程为Y=0.206 7X-0.009 2，R2为0.995 1，说明了相关度较高，木酚素的含量可以通过此标准曲线进行计算。

3.2 亚麻籽饼粕木酚素提取的单因素试验结果

3.2.1 乙醇浓度对木酚素得率的影响

乙醇浓度对木酚素得率的影响见图2。

从图2可以看出，随着乙醇浓度的增加，木酚素得率先升高后下降，浓度由30%变化到60%时得率增加，60%时出现峰值，得率最高，超过60%时得率会下降，原因是乙醇浓度过高会使一些醇溶性杂质色素和亲脂性强的成分溶出量增加。所以乙醇浓度选择60%最适。

图2 乙醇浓度对木酚素得率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on lignan yield

3.2.2 微波时间对木酚素得率的影响

微波时间对木酚素得率的影响见图3。

图3 微波时间对木酚素得率的影响Fig.3 Effect of microwave time on lignan yield

从图3可以看出，随着微波时间逐渐延长，木酚素得率先升高后下降，1.5 min时得率最高，超过1.5 min会溶出少量的亚麻胶，溶液黏度增加，使木酚素溶出受阻，也会由于时间太长造成容器炸裂。所以微波时间选择1.5 min最为合适。

3.2.3 微波功率对木酚素得率的影响

微波功率对木酚素得率的影响见图4。

图4 微波功率对木酚素得率的影响Fig.4 Effect of microwave power on lignan yield

从图4可以看出，微波功率由200 W到300 W时，木酚素得率逐渐上升，在300 W时出现峰值，超过300 W时得率逐渐下降，原因是功率过大会造成反应剧烈，破坏木酚素成分，使得率降低。所以选择300 W功率较好。

3.2.4 不同料液比对木酚素得率的影响

料液比对木酚素得率的影响见图5。

图5 料液比对木酚素得率的影响Fig.5 Effect of feed liquid ratio on lignan yield

从图5可以看出，随着溶剂体积增加，得率先增加后降低，在1∶20（g/mL）时达到最大值，溶剂体积增加，得率下降的原因是溶剂过量不能将木酚素的细胞壁破碎，微波作用不完全，成本也会增加，综合考虑选择 1∶20（g/mL）时最为合适。

3.3 亚麻籽饼粕木酚素提取的响应面试验优化结果分析

3.3.1 响应面试验设计及结果

通过单因素试验结果得出4个因素的最大取值，进一步进行四因素三水平的响应面试验优化。响应面分析法的因素水平见表1，响应面试验结果见表2，方差分析见表3。

表1 响应面分析法的因素与水平表Table 1 Factors and level tables of response surface analysis

表2 响应面试验结果Table 2 Response surface test results

续表2 响应面试验结果Continue table 2 Response surface test results

表3 响应面试验方差分析Table 3 Response surface test variance analysis

使用最新版Design Expert V 8.0.6响应面软件进行分析，得到亚麻籽饼粕木酚素提取的4个因素的二次回归模型：木酚素得率=14.74+0.71A+0.23B+0.59C+0.35D-0.66AB+0.43AC+0.23AD-0.60BC-0.59BD-0.82CD-0.94A2-0.74B2-0.95C2-0.21D2

由表3可以看出，模型的F值为31.76，P＜0.000 1，说明模型的可信度较高，能正确的反应出4个因素与响应值之间的关系变化，R2=0.969 5，接近于1，Radj=0.939 0，说明二次多项式方程能够充分拟合试验数据，且拟合程度较好。4个因素对木酚素得率的显著性也可以根据P值来判断大小，P＜0.01，说明对木酚素得率影响极显著，如果P＜0.05则影响显著，软件中的A、C、CD、A2、B2、C2表现为差异极显著，B、D、AB、AC、BC、BD表现为差异显著。由A、B、C、D的F值大小可以得出各因素对木酚素得率的影响顺序为A＞C＞D＞B。

响应面曲面分析见图6。

图6 两两因素交互作用的响应面Fig.6 Response surface of the effect interaction of two factors

通过观察等高线形状和坡面陡峭程度来判断每两个因素相互作用是否显著。如果是椭圆形且坡面越陡峭，表示两因素交互作用显著，对得率影响较大，如果是圆形，表示两因素交互作用不显著，由图6可知，CD交叉作用最显著，其次是AB和BC的交互作用较显著，这与方差分析的结果一致。通过方差结果得出4个因素对得率的影响顺序是：乙醇浓度＞微波功率＞料液比＞微波时间。

3.3.2 响应面试验优化及验证试验

通过Design Expert V 8.0.6响应面软件，根据回归模型预测亚麻籽饼粕中木酚素最佳提取工艺为：乙醇浓度60.08%，微波时间1.47 min，微波功率300.44 W，料液比1∶20（g/mL），此时木酚素的理论得率为14.82 mg/g。根据预测条件和实际操作所得到的木酚素提取最优工艺条件为：乙醇浓度60%，微波时间1.5 min，微波功率 300 W，料液比 1 ∶20（g/mL），按照此工艺条件进行3次平行试验，测得亚麻籽饼粕的平均木酚素得率为14.74 mg/g，实测结果和预测结果接近，表明该模型的拟合程度较好，数据准确可靠，能够更好地描述响应面法优化木酚素得率随提取条件的变化规律。因此，该模型具有可行性。

3.4 亚麻籽饼粕木酚素抗氧化试验结果

不同浓度亚麻籽饼粕木酚素与VC对DPPH自由基的清除效果见图7，不同浓度亚麻籽饼粕木酚素与VC对O2-·的清除效果见图8，不同浓度亚麻籽饼粕木酚素与VC对·OH的清除效果见图9。

图7 不同浓度亚麻籽饼粕木酚素与VC对DPPH自由基的清除效果Fig.7 Different concentrations，lignans and flaxseed cake VC DPPH free radical scavenging effect

图8 不同浓度亚麻籽饼粕木酚素与VC对O2-·的清除效果Fig.8 Different concentrations，lignans and flaxseed cake VCto O2-·scavenging effect

图9 不同浓度亚麻籽饼粕木酚素与VC对·OH的清除效果Fig.9 Different concentrations，lignans and flaxseed cake VCto·OH scavenging effect

从图7～图9可以看出，随着浓度的增加，清除率逐渐增加，并与VC进行对比结果显示，木酚素和VC都具有较好的清除能力，图7木酚素IC50值为94.629 mg/L，VC的IC50值为102.755 mg/L，图 8木酚素IC50值为0.253 mg/L，VC的IC50值为0.8928 mg/L，图9木酚素IC50值为 91.558 mg/L，VC的 IC50值为 103.155 mg/L，清除能力都大于VC，这可能是由于它们的结构中都含有酚羟基，能够与自由基反应生成一个相对较大的共轭体系，因此自由基电子是相对稳定和分散的，能够使亚麻籽饼粕显示出良好的抗氧化活性。

4 结论

通过本试验研究，探索出一种从亚麻籽饼粕中提取木酚素的新方法，利用微波辅助法从亚麻籽饼粕中提取木酚素的最佳工艺条件为：乙醇浓度60%，微波时间 1.5 min，微波功率 300 W，料液比 1 ∶20（g/mL），木酚素得率为14.74 mg/g，亚麻籽饼粕木酚素具有较高的 DPPH 自由基、O2-·、·OH 清除能力，IC50值分别为94.629、0.253 mg/L 及 91.558 mg/L，且均优于 VC。在浓度为250 mg/L和1 mg/L时，清除率达到76.28%、89.94%及86.38%。生物活性物质木酚素可以作为天然抗氧化剂进行开发和利用，为下一步在食品、生物医药领域的开发和应用奠定了基础。