用Morris水迷宫分析银杏叶提取物干预的乏运动大鼠的学习和记忆能力〔1〕

魏攀凤，程晶

(泉州医学高等专科学校，福建 泉州 362000)

体力活动缺乏综合征(SSeDS)最早出现在美国的医学和体育研究的文献中，也可以翻译成“久坐生活方式致死症”，它是一种慢性的由于运动缺乏引起的疾病，会增加其他疾病死亡率和致残率，甚至引起一些可预防疾病的出现。影响的范围遍布全球，特别是科技进步的现代社会，人们依靠机械电子改变了原来的生活方式，节省了尽可能多的体力活动，使SSeDS成为影响公众健康的重要因素[1]。美国克利夫兰诊所研究小组发表的一项研究称，久坐不动、运动能力缺乏、不愿意消耗体力比吸烟和糖尿病、心脏病对健康危害更大[2]。全球死亡的危险因素中缺乏运动已成为全球第四位的主要危险因素，占6%。相关研究认为，乳腺癌、直肠癌、糖尿病、心脏病都与缺乏运动有关，特别是缺血性心脏病，30%的患者可以归结为缺乏运动[3]。因此，我们通过建立动物模型，研究缺乏运动对大鼠的影响，并通过银杏叶提取物的干预疗法观察Morris水迷宫实验中大鼠学习和认知能力的变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物

经过动物伦理委员会批准，选择有资质的上海斯莱克动物实验有限责任公司提供的24只雄性SPF级别的SD大鼠，饲养于泉州医学高等专科学校SPF动物实验室内。

1.2 动物模型的建立

将24只大鼠随机分成正常组、乏运动组和银杏叶提取物干预组(干预组)，每组8只。正常组每4只放入535 mm×390 mm×200 mm笼子内，配304不锈钢网盖一个，双水瓶喂养，保证有足够的活动空间和食物及水。乏运动组和干预组单只单独关入285 mm×178 mm×150 mm笼子内，配一个304不锈钢网盖，单瓶水喂养，只保证能够翻身及足够的吃食和水，干预时间为8周，后按照6 mg/kg对干预组大鼠腹腔注射给药(银杏叶提取物)，单只给药不超过1 mL，其余给予相应剂量的生理盐水。8周后测量三组大鼠在Morris水迷宫中寻找相应位置平台的能力及撤离平台后还能到达相应位置的空间记忆能力。

1.3 实验药物

银杏叶提取物注射液(金纳多)，每支含有银杏叶提取物17.5 mg，其中银杏黄酮苷4.2 mg。辅料为山梨醇、乙醇、氢氧化钠。批准文号：HC20090014。生产企业：台湾济生化学制药厂股份有限公司。规格为5 mL：17.5 mg×10支。

1.4 实验仪器

SuperMaze Morris 水迷宫视频分析系统。

1.5 行为学检测

Morris水迷宫试验：将大鼠头朝池壁放入水中，放入位置随机，可以取60°，120°，180°，360°的角为起始位置，开始60 s的引导实验，如果大鼠在60 s内找不到平台则引导大鼠到达平台，并在平台上停留10 s。每只每天训练4次，每次训练时间间隔为15～20 min，连续训练4 d。第5天开始，将平台撤除，将动物由原先的4个位置放入水中。记录动物在水中的活动轨迹、进入平台位置所花的时间及撤掉平台后大鼠进入平台范围内的次数，以此作为空间记忆的检测指标。

2 结 果

2.1 Morris水迷宫运动轨迹

正常组、乏运动组、干预组的运动轨迹见图1～图3。在引导实验中乏运动大鼠的轨迹分布在4个象限内，密集遍布整个水池；正常组的轨迹相对集中在平台所在的第一象限内，轨迹相对稀疏；银杏叶提取物干预后的大鼠在水池内的活动轨迹相对于乏运动大鼠更为稀疏。

图1 正常组运动轨迹

图2 乏运动组运动轨迹

图3 干预组运动轨迹

2.2 到达Morris水迷宫平台次数

前面4 d为引导实验，大鼠到达平台结束录影。正常组60 s内都能找到平台，乏运动组结束录影还未能找到平台的只数多于干预组。第五天开始记录鼠的空间记忆能力即经过平台范围的次数。发现正常组立刻就能通过平台区域；乏运动组个别停止活动静止漂浮水面，个别老鼠无规律大范围游动；干预组明显有寻找平台的行为，并且通过平台区域的次数较多(见图4)。

图4 三组大鼠在水迷宫中到达平台的次数

3 讨 论

我们通过笼子限制大鼠的活动范围，建立缺乏运动的模型，而后让其进入水迷宫中，观察大鼠的行为学变化即学习和记忆能力。在时代发展的电子化社会环境下，电子设备替代大部分的手动作业导致人体活动能力缺乏，运动量明显减低。大量研究分析证实，缺乏运动对于人类来说增加了罹患心肌梗塞、心绞痛、心律失常、结肠癌、乳腺癌的风险。缺乏运动已经被世界卫生组织列入十大死亡的风险因素[4-6]。Laufs等[7]首先通过动物实验证实，乏运动有别于传统心血管疾病风险因子，如氧化应激、炎症反应等，能引起动脉内皮细胞功能受损。本研究在前期研究中，只对大鼠进行限制活动这个单一的干预，模拟了人类久坐缺乏运动的生活方式以及有中等强度的有氧运动模式，揭示其不同运动量对于无基础疾病状态下大鼠在水迷宫中的空间学习和记忆能力的影响。研究发现乏运动组的大鼠内皮依赖性舒张功能下降，同时一氧化氮合成酶(eNOS)表达下调。在多普勒超声检测中，我们发现乏运动组腹主动脉血管壁顺应性降低[8]。自20世纪60年代，德、法两国科学家率先从中国古老树种——银杏的树叶里提取出具有抗心脑血管疾病的成分(银杏黄酮与银杏内酯)，以“梯保宁”和“金纳多”为代表的银杏叶制剂在国际医药市场上声誉鹊起。据美国经济学家估计，目前全球各种银杏叶制剂加上形形色色的银杏保健食品与含银杏叶提取物成分的化妆品等市场总销售额已超过50亿美元。由于银杏叶提取物(EGB)具有明显的抗氧化、改善微循环及脑保护等作用，临床上常用于辅助治疗糖尿病、心脑血管疾病、血管性痴呆等[9]。

陈红辉等[10]建立老龄痴呆大鼠模型，研究发现银杏叶提取物可改善学习记忆能力。我们通过水迷宫实验发现了大鼠在运动缺乏状态下的行为偏激且敏感和焦虑，而正常大鼠在学习记忆力上远远优于缺乏运动的大鼠，值得一提的是银杏叶提取物干预后大鼠的学习记忆能力明显不同于缺乏运动大鼠。本研究为以后的实验提供了新的依据，初步揭示银杏叶提取物改善久坐乏运动大鼠行为学的作用机制。该项目的成功实施有利于银杏叶提取物药用价值的开发，为银杏叶提取物在临床用药提供了理论基础。