脑梗死患者骨保护素基因多态性与血浆中骨保护素水平的关系

宫青 魏玲 曲红梅 赵洪芹

(1 青岛大学附属医院神经内科，山东 青岛 266003； 2 威海市文登区人民医院)

脑梗死是一种由环境和遗传因素共同作用而引起的多基因疾病[1]。近年来，随着分子遗传学技术的进步，脑梗死发病相关基因遗传学研究也日益受到关注，寻找脑梗死相关致病基因已经成为当前研究的热点[2]。骨保护素(OPG)是肿瘤坏死因子(TNF)超受体家族中的一种糖蛋白，同时也是TNF相关凋亡诱导配体的受体，是凋亡的有效激活因子[3]。王猛猛等[4]研究表明，OPG基因多态性与LAA型脑卒中易感性有关。CAO等[5]研究显示，OPG基因rs3102735位点多态性与脑梗死的发生以及严重程度有关[6]，但是OPG基因多态性是否与血浆中OPG水平相关尚不明确。本研究旨在探讨OPG基因多态性与血浆中OPG水平的关系，为进一步探讨OPG与LAA型脑梗死间的相关性提供参考依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2016年11月—2018年11月我院神经内科住院的LAA型脑梗死患者221例(LAA组)，患者均符合第四届全国脑血管病会议修订的诊断标准，经颅脑CT或MRI确诊为脑梗死，并行头颈部血管检查，包括颅脑磁共振血管造影(MRA)和(或)头颈部CT血管造影(CTA)或全脑血管造影(DSA)确诊为颈内动脉或大脑中动脉区脑梗死。按照经典TOAST病因分型确定为LAA型脑梗死[7]。入选标准:责任血管动脉粥样硬化性狭窄程度≥50%，患者均于发病72 h内入院。排除标准：①由心源性栓塞、小血管型梗死、不明原因及其他原因导致的脑梗死，如动脉夹层、大动脉炎、血液病、烟雾病、药物等。②病情危重者；③近期使用了免疫抑制药，有明显的心、肝、肾功能不全以及急慢性感染、恶性肿瘤的患者；④近半个月服用了影响凝血功能的药物或者既往有脑梗死病史者。选择同期于我院体检中心查体的健康者115例为对照组。入选标准：既往无脑梗死病史，颅脑CT或MRI检查示无急性期脑梗死；血管检査无明显颅内外动脉粥样硬化及狭窄的证据。本研究经青岛大学附属医院伦理委员会批准(QDDXYXYFSXY-2014-005)，所有研究对象及家属均了解研究目的并签署知情同意书。

1.2 样本采集和实验室检测

清晨空腹采集所有受试者的前臂静脉血8 mL，4 mL血液以3 000 r/min离心10 min分离血浆，将血浆转移到聚丙烯管中，于-70 ℃冻存待测OPG浓度。血浆中OPG浓度采用人OPG ELISA试剂盒(R&D System公司，美国)测定。检测间和检测内变异系数分别为5.7%和4.9%。另外4 mL静脉血以3 000 r/min离心15 min后分离血清，采用全自动生化分析仪(北京泰林东方商贸有限公司)检测受试者血清中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)、葡萄糖(GLU)、三酰甘油(TG)水平。

1.3 基因扩增

采用标准方法提取受检者外周血白细胞基因组DNA，应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测OPG基因多态性。以GenBank为参考基因序列，由北京圣工股份有限公司设计并且合成引物。使用美国Applied Biosystems 2720PCR扩增仪，TaKaRa LA Taq with GC缓冲液反应试剂进行PCR扩增。总反应体系25 μL,包括DNA模板4 μL，LA Taq酶1 μL，及2×缓冲液12.5 μL，dNTP Mixture 4 μL，10 μmol/L上下游引物各0.6 μL,加双蒸水至25 μL。PCR扩增条件为94 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，扩增30个循环；最后72 ℃延伸7 min。

1.4 基因型鉴定

取PCR扩增产物4 μL，加入限制性内切酶AseⅠ(新英格兰生物学实验室，北京) 1 μL和缓冲液2.5 μL，加双蒸水至8 μL，于37 ℃恒温水浴1 h，然后进行电泳。使用Tanon 4200 SF 全自动荧光/化学发光成像分析系统(上海天能科技有限公司)观察PCR扩增情况并拍照。

1.5 统计分析

2 结 果

2.1 OPG基因rs3102735位点多态性的酶切电泳结果

OPG基因rs3102735位点多态性的酶切电泳结果见1图，TT型被酶切为161、139 bp 2个片段；CC型不能被酶切，片段长度为300 bp；CT型被酶切为300、161和139 bp 3个片段。

①、②、③分别为基因型CT、CC、TT，M为Marker

2.2 对照组和LAA组一般临床资料比较

LAA组和对照组年龄、性别、糖尿病构成比、冠状动脉粥样硬化性心脏病(CAD)构成比及LDL-C、TG、TC水平相比较差异无统计学意义(P>0.05)；LAA组高血压、吸烟、饮酒的发生率及OPG表达水平高于对照组，差异具有统计学意义(χ2=2.488～5.890，t=4.826，P<0.05)。见表1。

表1 对照组和LAA组一般资料比较

2.3 两组OPG基因rs3102735位点基因型及等位基因频率分布比较

经Hardy-Weinberg平衡检验，两组OPG基因rs3102735位点基因型及等位基因频率分布均处于遗传平衡状态(P>0.05)。由于rs3102735位点的C等位基因分布较少，所以将CC和CT基因型合并后进行基因型分析。LAA组CC/CT基因型和C等位基因分布频率明显高于对照组(χ2=6.408、8.903，P<0.05)。在调整混杂因素(高血压、吸烟、饮酒)后，CC/CT基因型、C等位基因与LAA型脑梗死的发生呈显著相关(OR=1.574，95%CI=1.063～3.154，P<0.05，OR=1.633，95%CI=1.182～2.665，P<0.05)。见表2。

表2 两组OPG基因rs3102735位点基因型及等位基因频率分布比较

2.4 两组OPG基因rs3102735位点基因型与血浆OPG水平的关系

LAA组CC/CT基因型及C等位基因患者血浆中OPG表达水平明显高于对照组(χ2=5.377、6.872，P<0.05)。在调整混杂因素(高血压、吸烟、饮酒)后，CC/CT基因型、C等位基因与高OPG水平有关(OR=1.002，95%CI=1.001～1.0003，P<0.05；OR=1.572，95%CI=1.019～2.425，P<0.05)。见表3。

表3 两组OPG基因rs3102735位点基因型与血浆OPG水平的关系

3 讨 论

研究显示，OPG可通过抑制某些黏附趋化因子的表达上调和血管内皮细胞的凋亡来发挥血管保护作用[8-9]。研究表明，血浆中OPG水平与动脉粥样硬化、脑梗死的发生及其严重程度有关[10-13]。本研究结果显示，LAA组血浆OPG水平显著高于对照组，提示血浆OPG水平增高可能与LAA型脑梗死的发病相关，与先前的研究结果一致[14-17]。脑梗死患者血浆中OPG水平增高的原因可能与OPG参与脑梗死急性期炎症反应、细胞凋亡和斑块不稳定等有关[18-20]。

OPG基因位于染色体8q23-24上，rs3102735多态性位点位于启动子上游的第759个碱基[21]。有研究表明rs3102735位点多态性与骨钙代谢、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎等疾病有关[22-24]，而与脑梗死是否具有相关性国内外鲜见报道。本研究结果显示，LAA组中C等位基因及其对应的CC/CT基因型的发生频率明显高于对照组，在调整了混杂因素(高血压、吸烟、饮酒)以后发现，OPG基因rs3102735位点C等位基因、CC/CT基因型与脑梗死的发病可能有关。进一步分析血浆中OPG水平与OPG基因多态性的相关性，发现携带C等位基因、CC/CT基因型的患者血浆中OPG水平明显高于对照组，提示OPG基因rs3102735位点的C等位基因和CC/CT基因型可能与血浆OPG高表达水平有关。OPG基因多态性与动脉粥样硬化相关，在OPG基因启动子区附近的位点可能对OPG基因的表达造成影响。

孙菲等[1]发现OPG基因多态性与LAA型脑梗死有关。王猛猛等[4]研究显示，OPG基因多态性与LAA易感性有关。还有研究发现OPG基因多态性与心血管疾病、多发性骨髓瘤、骨质疏松等多种疾病相关[25-28]。但范雪等[29]对中国辽宁地区汉族人群研究表明，OPG基因多态性与LAA易感性无显著相关性，与本研究结果不一致，可能与研究所选人群地区差异及样本量多少有关。

本研究显示LAA患者血浆中OPG水平显著增高，rs3102735位点C等位基因、CC/CT基因型发生频率高，C等位基因及其对应的CC/CT基因型患者血浆中OPG水平也增高，提示C等位基因及CC/CT基因可能与OPG水平相关，C等位基因及CC/CT基因可能通过调整LAA患者的OPG水平来增加卒中的发生。然而由于脑梗死的发病机制较为复杂，未来尚需对OPG引起LAA型脑梗死的具体机制进行更加深入探讨，为脑梗死的病因学研究以及防治策略提供科学的证据。

本研究还存在一定的局限性。首先，本实验只涉及到OPG单基因启动子区的1个多态性位点，并不能代表整个基因组；其次，样本量小，且仅限于山东汉族人群，不能排除种族及地区的差异；第三，LAA组仅选择了LAA型脑梗死患者；第四，LAA组均为住院患者，大多数患者在入院前都进行了降压、降糖的治疗，可能干扰了危险因素对血浆OPG调节的观察。

总之，LAA型脑梗死患者血浆中OPG水平增高，OPG基因rs3102735位点C等位基因及其对应的CC/CT基因型可能与血浆高OPG水平有关。