典型化工污水处理厂废水及受纳水体的生物急性毒性监测方法应用研究

张小琼，沈伟，刘杰，施昕澜，朱冰清，姜晟

(1.江苏省环境保护水环境生物监测重点实验室，江苏 常州 213001；2.江苏省常州环境监测中心，江苏 常州 213001；3.江苏省环境监测中心，江苏 南京 210019)

我国对化工污水处理厂排放的废水主要检测其理化因子，并颁布了相应的排放标准[1-2]，但大量新型污染物对环境和人体健康也存在巨大影响，常规理化因子的检测已不能满足污染控制的需求。目前，已有一些国家针对环境生物毒性制定了检测和评估标准，并规定了污染物排放限值。我国在2008年制药工业系列排放标准(GB 21903—GB 21908)中首次引入了综合毒性指标，后续在2015年颁布的《城镇污水处理厂污染物排放标准》(征求意见稿)[3]和2017年颁布的《农药工业水污染物排放标准》(征求意见稿)[4]中，对城镇污水和农药工业水污染物排放限值分别引入了4项综合毒性指标。德国污水排放标准[5]采用5项综合毒性指标，对不同化工行业提出不同的排放限值。

近年来，采用的生物毒性效应检测方法包括：发光细菌急性毒性[6-7]，藻类荧光抑制毒性[8-9]，斑马鱼急性毒性[10-11]，遗传毒性[12-13]，以及内分泌干扰物毒性[14-15]等。使用不同类型组合的生物毒性检测，对环境中各层次生物毒性效应进行综合评价已成为主流[16-19]。

邹叶娜等[20]运用成组生物毒性测试法对典型工业废水的综合生物毒性进行了评价，并评估了处理工艺对毒性的削减情况。陈玲等[21]运用毒性鉴别评价(TIE)技术进一步对工业废水中的致毒物质进行了鉴别。

因各工业园区内企业类型存在差异，且配套的污水处理厂废水处理工艺流程不同，废水成分差异较大。本研究选择了常州2个污水处理厂为研究对象(以下简称“常A”和“常B”)，常A污水处理厂主要处理生产化工原料、化工新材料、生物化工、新领域精细化工等产生的污水，设计污水处理能力为30 000 m3/d。常B污水处理厂主要处理以机械、织造为主的轻污染工业污水，配备了3辆10 t槽罐车从事工业废水的收集、运输、处理工作，设计污水处理能力为5 000 m3/d。2个污水处理厂处理后的尾水最终都汇入自然水体。现选择4种不同生物层次的生物急性毒性检测方法组合进行研究，比较不同类型污水处理厂废水的差异，了解4种生物急性毒性检测方法的适用性，以期为化工园区废水的生物毒性削减管理提供方法和依据。

1 研究方法

1.1 样品采集

按照《地表水和污水监测技术规范》(HJ/T 91—2002)[22]要求进行样品采集。采样点位：污水处理厂进水口、尾水排放口、受纳河道上游100 m、受纳河道下游100 m。采样频次：1次/2周，每批次样品空白、平行样各1个。采集后在4 ℃下于冷藏箱中保存运输，至实验室后立即分析，不能立即分析的，按方法要求冷冻或冷藏。

1.2 仪器与受试生物

仪器：DeltaTox发光细菌毒性检测仪(美国SDI公司)；TOXY-PAM叶绿素荧光毒性测定仪(上海泽泉科技股份有限公司)；SMZ 1000体式显微镜(日本尼康公司)。

受试生物：费氏弧菌(Vibriofischeri)，购自英国Modern Water公司；斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)，菌种购自中国科学院淡水藻种库，江苏省常州环境监测中心自行繁育；大型溞(Daphniamagna)，溞种由南京大学提供，江苏省常州环境监测中心自行繁育；鱼卵取自斑马鱼(Daniorerio)，种鱼购自国家斑马鱼资源中心，江苏省常州环境监测中心自行繁育。

1.3 生物毒性检测方法及评价指标

发光细菌急性毒性检测方法为《水质 水样对弧菌类光发射抑制影响的测定(发光细菌试验)》 第3部分:使用冻干细菌法(ISO 11348-3-2007)[23]；藻类叶绿素荧光毒性检测参考SCHREIBER等[24]的方法；大型溞急性毒性检测方法为《大型溞急性毒性实验方法》(GB/T 16125—2012)[25]；斑马鱼卵急性毒性检测方法为《水质 急性毒性的测定 斑马鱼卵法》(HJ 1069—2019)[26]。

相对发光率(L)>90%，为无毒；70%

2 结果与讨论

2.1 发光细菌急性毒性

常A污水处理厂排放的尾水最后进入长江干流，因水流量巨大，未采集受纳水体代表样品，仅对水厂进出水进行了发光细菌急性毒性检测。图1为常A进出水样相对发光率实验结果。进出水口样品经过8次检测，发现发光细菌急性毒性介于无毒至高毒，表明每次检测的进水样品毒性差异较大，可能与所含有毒物质类型和浓度的变化有关。出水口样品发光细菌急性毒性介于无毒至低毒，且投放的消毒用氧化剂逐渐耗尽后，后续也未检测出急性毒性，表明该处理厂污水经深度处理后，毒性削减较大。

图1 常A进出水样相对发光率实验结果

常B污水处理厂采用槽罐车非定时收集各企业污水，污水量和来源不稳定，其出水通过厂门口的水沟流入附近水体。图2为常B进出水样相对发光率实验结果。进水口样品经过2次检测，相对发光率为15.8%和5.70%(均为高毒)，2次出水口样品检测结果差异较大，相对发光率分别为0(剧毒)和84.7%(低毒)。当受纳河道上游水样检出为无毒(第1次检测)，而出水发光细菌急性毒性为剧毒时，受纳河道下游水样急性毒性检出为中毒，说明受纳水体水容量较小时，下游水体的生物毒性会受到排放尾水的影响。该污水处理厂出水口样品2次检测的毒性差异显著，可能与最后一道处理工艺投放氧化消毒剂有关。

图2 常B进出水样相对发光率实验结果

2家污水处理厂进水均呈现较大毒性，分别经过不同工艺处理后，毒性得到大幅削减。王丽莎等[28]检测了北京市3个污水处理厂不同处理阶段的发光细菌急性毒性，发现其随工艺流程呈降低趋势，最后出水表现出对发光细菌有抑制作用。杀菌用氧化消毒剂的使用对尾水毒性有较大影响，与本研究结果一致。宋莹[29]研究结果发现，氧化消毒剂(余氯)对发光细菌的急性毒性会造成干扰。建议在进行出水毒性检测时，加入脱氯剂以减少氧化消毒剂引起的急性毒性，以便更好地反映真实的排水毒性。

2.2 藻类叶绿素荧光抑制毒性

图3为常A进出水叶绿素荧光毒性抑制率，图4为常B进出水以及受纳河道上下游藻类叶绿素荧光的毒性抑制率检测结果(常A检验5次，常B检测2次)。由图3可见，常A所有检测中，仅第1次进水的荧光毒性抑制率>20%，其余未检出明显的毒性抑制效应。由图4可见，常B进水具有明显的荧光抑制毒性，第1次进水抑制率最高值为62.88%，第2次进水抑制率最高值为34.98%。第1次出水抑制率<20%，第2次出水抑制率>25%。受纳河道上下游2次检测，荧光抑制率均<20%，未发现明显的藻类荧光抑制毒性。

图3 常A进出水叶绿素荧光毒性抑制率

图4 常B进出水及受纳河道上下游叶绿素荧光毒性抑制率

常A和常B藻类荧光急性毒性检测结果具有差异，可能由于2个污水处理厂进水所含污水的成分不同，段静波等[30]发现，Hg2+、Cd2+、Cu2+、Zn2+4种重金属离子混合后可对蛋白核小球藻产生联合毒性。常B处理的废水主要来源于机械和织造工业，其重金属含量较高，因此检测出较高的藻类叶绿素荧光毒性。

常B排放的尾水其荧光抑制率低于进水，说明处理工艺对藻类叶绿素的荧光抑制有一定的削减作用。戴迪楠[31]对污水处理厂各处理工艺段进行了4种生物毒性的检测，其中二级生物处理可有效减少藻类抑制毒性，削减幅度达94%以上，与本研究结果一致。

2.3 大型溞急性毒性

修订的《农药工业水污染物排放标准》(征求意见稿)对农药工业水污染物排放限值进行了规定：大型溞急性毒性的限值为稀释8倍后进行 48 h测试，大型溞受抑制率≤10%，视为达标。德国水污染物排放标准对化工企业溞类毒性TD(DIN 38412-L30-1989)[32]规定的限值为：稀释8倍后进行24 h测试，测试终点为“均具有游动能力”。

对常A 8次进出水原水水样，以及10，100，1 000倍逐级稀释的进出水水样进行毒性检测，均未检测出大型溞的死亡，表明无急性毒性。表1为常B进出水以及受纳河道上下游大型溞存活数检测结果，由表1可见，常B进出水原水中大型溞全部死亡，进出水均显示出很强的急性毒性。随稀释倍数的增加，死亡率逐渐下降，稀释至1 000倍，未检测出急性毒性。而常B的进出水稀释10倍后死亡率为80%～100%；进出水稀释至100倍后，第2次采样的进水未检测出急性毒性，其余死亡率为20%～40%，显示毒性减小；稀释至1 000倍后未观察到毒性。参照上述2个标准的排放限值，常B的出水不符合排放要求。

初步推断该毒性来源为出水排放中添加的氧化消毒剂，朱英等[33]研究了含对氯间二甲苯酚、次氯酸钠2种消毒剂对溞类的毒性，发现氧化消毒剂类的次氯酸钠类比对氯间二甲苯酚类更高，对生态环境相对不友好。在本研究中，常B使用含氯氧化消毒剂，建议常B的排水用非氧化或其他对环境友好型消毒工艺进行替代。若要减少对生态环境的影响，后续需进一步查明大型溞毒性来源是否来自氧化消毒剂，并对应进行处理工艺的改进，减低毒性后达标排放。

表1 常B大型溞死亡率检测结果① %

2.4 斑马鱼卵急性毒性

斑马鱼是水生生物毒性检测普遍使用的模式物种，用于鱼类生物毒性研究[34-35]。斑马鱼卵相对斑马鱼成鱼在生物急性毒性检测上具有显著优势——个体小、数量大、检测时间短，有毒物质在生物发育过程中产生的影响更直观。本研究采用斑马鱼卵来检测水样的毒性，对原水和5个稀释度(50%，33%，25%，16.7%，12.5%)水样的毒性来进行评估。在测试中不产生测试效应的最低稀释倍数(lowest ineffective dilution，LID)指不少于90%鱼卵存活时水样的最低稀释倍数。对常A和常B的进出水以及受纳河道上下游斑马鱼卵急性毒性进行检测，常A进行8次检测，常B进行2次检测。结果表明，常A进出水原水基本未检测出毒性，LID值为0，常B进出水以及受纳河道上下游斑马鱼卵急性毒性检测结果见表2。由表2可见，常B 2次进水的LID值均为16，出水分别为6和3，受纳河道上下游均未检出急性毒性。出水和受纳河道下游虽检测到的LID值不高，但存在斑马鱼卵各类发育畸形现象，出水原水稀释3倍，受纳河道原水稀释2倍后仍可观察到发育畸形，见图5(a)(b)(c)(d)(e)(f)(g)。

表2 常B进出水以及受纳河道上、下游斑马鱼卵急性毒性检测结果①

图5 常B出水和受纳河道下游斑马鱼卵发育畸形类型(斑马鱼卵发育照片放大倍数均为20×2倍)

2.5 筛选生物急性毒性检测方法的应用

发光细菌急性毒性、藻类叶绿素荧光毒性、大型溞急性毒性、斑马鱼卵急性毒性4种生物急性毒性在常A和常B 2个污水处理厂的测试结果差异较大。发光细菌急性毒性、藻类叶绿素荧光毒性2项指标在2个污水处理厂进水中全部检出，大型溞、斑马鱼卵急性毒性仅在常B中有检出。对污水处理厂的尾水和受纳河道的检测中，仅发光细菌急性毒性在2个污水处理厂中有检出。根据实验结果，4项生物毒性指标能够满足2个工业园区的生物毒性检测，并有较好的指示效果，见表3。

表3 常A、常B污水处理厂4种生物监测技术比较

废水经过处理后，污染物大幅减少，但尾水中仍然含有难降解的物质，如重金属、抗生素和药物类化合物等，对受纳水体水环境的影响不容忽视[36]。在规定生物指标的现有标准中，《德国水污染物排放标准》采用了5项生物毒性指标，包括：鱼卵毒性(Tegg)、溞类毒性(TD)、藻类毒性(TA)、发光细菌急性毒性(TL)和致突变性(基因毒性测试，umu测试)。参考该标准制修订的《城镇污水处理厂污染物排放标准》(征求意见稿)保留了前4项，删去了基因毒性测试，并同时规定了各指标的排放限值。国内也有一些研究采用多种生物毒性检测方法组合对污水处理厂尾水的毒性进行检测，如田杰等[37]采用了青海弧菌Q67和蚕豆根尖微核遗传实验对3个城市污水处理厂进出水进行了研究，刘存歧等[38]采用了羊角月牙藻、大型溞、斑马鱼、费氏弧菌及蚕豆微核遗传实验进行了污水处理厂尾水的研究。但其中使用的一些方法或对人员要求较高，或耗时很长(藻类生长抑制)，或需要专门的实验场所，不利于环境监测基层普及推广使用。本研究在比较了国内外各种生物毒性指标的基础上，尽可能筛选更快速、更便捷，又能覆盖各生物层次的生物毒性方法进行组合。因此，对《城镇污水处理厂污染物排放标准》(征求意见稿)的4项指标进行优化，将标准中使用的藻类毒性(藻类生长抑制毒性)替换为植物藻荧光抑制毒性，大幅缩减实验时间，降低对人员的要求。这4种方法可应用于水环境中鱼类、浮游植物、浮游动物、微生物等生物链的毒性效应，能更及时地监测环境变化对生物的影响。改良优化后的方法组合，可为化工污水处理厂尾水排放的生物毒性常态化监控提供有力的监测手段。

3 结论

(1) 工业园区污水处理厂进水对大部分受试生物均具有毒性，经过工艺处理后，出水毒性一般低于进水，但处理工艺尤其是氧化消毒剂的使用可能会对出水的生物急性毒性造成影响。如斑马鱼卵在受纳河道下游水样中检测到畸形发育，如果不采取措施进行及时干预与处理，会影响水体安全并可能导致水环境存在潜在的健康风险。因此应合理选用消毒剂，并可用生物进行毒性检测。同时建议对污水处理厂各处理环节进行毒性检测，根据检测结果优化处理工艺，达到无毒减排的目的。

(2) 发光细菌急性毒性测试范围最广，适用于各类水样的监测；其他生物急性毒性检测方法适用于不同类型的工业园区水质监测，如藻类叶绿素荧光毒性可用于重金属类、除草剂类及其他抑制光合作用废水检测；大型溞对化工类为主的废水敏感度低于机械、织造类废水；斑马鱼卵可用于检测环境水样对生命早期发育的影响。

建议将不同生物层级生物急性毒性指标纳入污水处理厂的常态化监测中，为管理部门进行污水排放监督提供数据支撑，弥补理化因子监测的不足。