参蒲盆炎颗粒对苯酚胶浆诱导子宫内膜炎大鼠核因子-κB信号通路的影响

孙兰 李家春 宗绍波 王振中

摘要 目的：观察参蒲盆炎颗粒对苯酚胶浆致子宫内膜炎大鼠模型的影响，探讨其抗炎作用机制。方法：选取SD大鼠60只并随机分为假手术组、模型组、参蒲盆炎颗粒高、中、低剂量组（15.0，7.5，3.75 g生药/kg）和妇科千金胶囊组（5.0 g生药/kg）。采用苯酚胶浆复制子宫内膜炎大鼠模型，连续灌胃给药21 d，比色法测定大鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平，HE染色评价大鼠子宫内膜的病理变化，酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测子宫组织肿瘤坏死因子（TNF-α）及白细胞介素-1β（IL-1β）的水平，蛋白免疫印迹法（WB）检测子宫组织中核因子-κB（NF-κB）的表达。结果：参蒲盆炎颗粒能明显改善子宫内膜上皮细胞增生、变性、坏死及炎细胞浸润等病理改变;参蒲盆炎颗粒高、中剂量组显著升高大鼠血清SOD水平及降低MDA水平;参蒲盆炎颗粒显著降低大鼠子宫组织IL-1β、TNF-α水平及核因子-κB蛋白的磷酸化水平。结论：参蒲盆炎颗粒对苯酚胶浆致子宫内膜炎大鼠有较好的治疗作用，其作用机制可能与其抑制核因子-κB通路激活有关。

关键词 参蒲盆炎颗粒;子宫内膜炎;苯酚胶浆;核因子-κB信号通路

Abstract Objective：To observe the effects of Shenpu Penyan Granules on endometritis induced by phenol mucilage and the explore anti-inflammatory mechanism.Methods：A total of 60 female SD rats were randomly divided into a sham operation group，a model group，a Shenpu Penyan Granules high dose group，a medium dose group and a low dose group （15.0，7.5，3.75 crude drugs g/kg） and Fuke Qianjing Capsule （5.0 g/kg）.Rat model of endometritis was copied with phenol glue.After the rats were treated 21 days by intragastric administration，the content of superoxide dismutase （SOD） and malondialdehyde （MDA） in serum of rats were determined by colorimetry.Pathological changes of endometrium of rates were evaluated by rats.Expressions of NF-kB in uterine tissue were detected by western blotting （WB）.Results：Shenpu Penyan Granules could improve obviously the pathological damage of endometrial epithelial cell proliferation，degeneration，necrosis and inflammatory cell infiltration.Shenpu Penyan Granules high and medium dose group significantly increased the serum SOD content and decreased MDA content.And Shenpu Penyan Granules significantly reduced the content of IL-1β，TNF-a and NF-kB protein phosphorus level in rat uterine tissue.Conclusion：Shenpu Penyan Granules have a good therapeutic effects on phenol-induced endometritis in rats and its mechanism may be related to the inhibition of NF-kB pathway activation.

Keywords Shenpu Penyan Granules; Endometritis; Phenol mucilage; NF-kB

中圖分类号：R289.5;R711.3文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.13.014

子宫内膜炎是女性生殖系统常见疾病，发病的原因与子宫内膜组织结构发生的炎性改变相关，是慢性盆腔炎的一种病理改变[1]。子宫内膜炎的临床表现主要包括腹部疼痛、痛经、经期血量过多、不孕等[2]。子宫内膜炎的发病率呈现上升趋势，严重威胁着患者的身心健康[3]。临床上西医常用抗生素和激素治疗子宫内膜炎，但是抗生素长期应用不良反应较多，并且易产生耐药性[4]。研究表明，中药治疗子宫内膜炎有独特的优势[5]。参蒲盆炎颗粒是临床经验方，由党参、虎杖、赤芍、蒲公英等药物组成，具有活血化瘀，清利湿热功效，主治腹痛、腹坠胀、腰酸痛、白带增多、月经不调、盆腔肿块，慢性盆腔炎见上述证候者。我们观察参蒲盆炎颗粒对苯酚胶浆所致大鼠子宫内膜炎的治疗作用，并探讨其抗炎作用机制，为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SD大鼠，SPF级，180～200 g，雌性，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2013-0016。动物分笼饲养，自由饮水和摄食，饲养室温度20～25 ℃，相对湿度为40%～65%，适应性饲养3 d后开始实验。

1.1.2 药物 参蒲盆炎颗粒（SPPYG）（江苏康缘药业股份有限公司，批号：160901）;妇科千金胶囊（FKQJC）（株洲千金药业股份有限公司，批号：201604015）。

1.1.3 试剂与仪器 水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司，批号：20161219）;羧甲基纤维素钠[中国医药（集团）上海化学试剂公司，批号：20150617];苯酚（国药集团化学试剂有限公司，批号：T20120919）;甘油（国药集团化学试剂有限公司，批号：T20151226）;黄蓍树胶粉（国药集团化学试剂有限公司，批号：Lot.No.WG20150527）;超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（批号：20170525）和丙二醛（MDA）试剂盒（批号：20170312），购于南京建成生物科技有限公司;白细胞介素-1β（IL-1β）（批号：20170629）和肿瘤坏死因子（TNF-α）ELISA试剂盒（批号：20170612），购于南京建成生物科技有限公司;抗NF-κB p65（货号：8242）;Phospho-NF-κB p65（Ser536）（货号：3033）及GAPDH抗体（货号：5174），购于美国CST公司;羊抗兔IgG-HRP（英国Abcam公司，货号：ab6721）。电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，型号：BSA224S];冷冻离心机（Eppendorf，德国，型号：CENTRFUGE5840型）;光学显微镜（德国莱卡，型号：DM 1000）;Flexstation3钙流工作站（Molecular Devices公司，美国，型号：FlexStation3）;ChemiDoc+XRS+显影仪（BIO-RAD公司，美国，型号：ChemiDoc+XRS）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 参照文献[6]，SD大鼠60只，其中50只用于子宫内膜炎动物模型制作，大鼠用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，腹部备皮消毒后沿腹部正中切口约2 cm，暴露子宫，每只大鼠在左侧子宫注入15%苯酚胶浆0.1 mL，右侧子宫不注射作为自身对照。另外10只SD大鼠为假手术组，仅进行开关腹手术操作，不注射苯酚胶浆造模，分层关腹，消毒术区。造模后所有大鼠正常喂养7 d后将大鼠随机分为假手术组，模型组，参蒲盆炎颗粒高、中、低剂量组（15.0，7.5，3.75 g生药/kg），妇科千金胶囊组（5.0 g生药/kg）。

1.2.2 给药方法 各给药组灌胃给予相应剂量药液或溶媒，灌胃体积均为10 mL/kg，1次/d，连续21 d。各组大鼠末次灌胃24 h后，10%水合氯醛麻醉，腹主动脉采血5 mL，3 000 r/min，离心半径15 cm，离心10 min分离血清，脱颈椎处死，取大鼠子宫，一部分10%甲醛溶液固定，供病理检测，一部分-80 ℃保存，供炎性反应递质及蛋白检测。

1.2.3 检测指标与方法

血清SOD、MDA检测：按试剂盒说明检测血清中SOD、MDA水平。

子宫组织炎性反应递质检测：取冻存的大鼠子宫组织，清除多余脂肪组织，称取适量子宫组织于2 mL EP管中，加入生理盐水（W/V：1∶9）后于冰上研磨均匀，4 ℃，3 000 r/min，离心半径15 cm，离心15 min后，分离上清根据IL-1β、TNF-α检测试剂盒说明书进行检测。

子宫组织病理检测：左侧子宫用10%甲醛溶液固定，常规切片，HE染色，光镜下进行子宫病理组织学检查。病理观察指标为：1）子宫腔有无粘连、闭塞或扩张;2）子腔壁结构有无改变;3）子宫内膜上皮细胞有无变性坏死;4）子宫壁有无慢性炎细胞浸润;5）子宫内膜有无充血水肿。根据病变由轻到重的程度分别记为0～4分，积分标准为：无病变记为0分;极轻度记为1分，轻度但病变范围<1/3记2分;中度病变、范围在1/3～2/3间记3分;重度病变、范围在2/3以上者记4分。炎细胞浸润程度积分标准为无炎细胞浸润记为0分;极少量记为1分;黏膜固有层有少量记为2分，肌层查见记为3分，全层皆有记为4分。类加所有分数，计算出每组动物的均分，分值越高提示盆腔炎病变程度越严重。

子宫组织核因子-κB蛋白检测在冰上剪取子宫组织100 mg左右，按照子宫组织：裂解液（裂解液与蛋白酶抑制剂以100∶1的比例混合）=1∶10比例，放入2 mL EP管中，用电动匀浆器充分匀浆，匀至无肉眼可看见的物质，14 000 r/min，离心半径 15 cm，离心10 min，分离上清。用BCA方法进行蛋白水平测定，12% SDS-PAGE分离，将蛋白转移到PVDF膜上，5% BSA封闭2 h，核因子-κB p65、Phospho-核因子-κB p65一抗（1∶1 000）4 ℃封闭过夜，羊抗兔IgG-HRP二抗（1∶2 000）37 ℃孵育2 h，利用ECL进行显色，拍照保存，用凝胶图像处理系统自动分析目的条带分子量和灰度值进行定量分析。

1.3 统计学方法 采用Graphpad Prism5.0统计软件进行实验数据处理，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 参蒲盆炎颗粒对苯酚胶浆诱导子宫内膜炎大鼠血清SOD、MDA水平影响 与假手术组比较，模型组大鼠血清SOD水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05），与模型组比较，妇科千金胶囊、参蒲盆炎顆粒高、中剂量组血清SOD水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与假手术组比较，模型组大鼠血清MDA水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.05），与模型组比较，妇科千金胶囊、参蒲盆炎颗粒高、中剂量组血清MDA水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 参蒲盆炎颗粒对苯酚胶浆诱导子宫内膜炎大鼠子宫组织炎性反应递质的影响 与假手术组比较，模型组大鼠子宫组织IL-1β水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，妇科千金胶囊、参蒲盆炎颗粒高、中剂量组大鼠子宫组织IL-1β水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）;与假手术组比较，模型组大鼠子宫组织TNF-α水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，妇科千金胶囊、参蒲盆炎颗粒高、中剂量组、低剂量组大鼠子宫组织TNF-α水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。見表2。

2.3 参蒲盆炎颗粒对苯酚胶浆诱导子宫内膜炎大鼠子宫内膜病理改变的影响 假手术组子宫组织结构正常，内膜上皮细胞未见变性、坏死，肌层未见增生。模型组大鼠子宫内膜上可见上皮细胞变性坏死，有散在或层状性炎细胞浸润，内膜充血水肿。参蒲盆炎颗粒各剂量组子宫内膜表面上皮轻度增生、增厚，炎性细胞浸润明显减轻。与假手术组比较，模型组病理综合评分显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，妇科千金胶囊、参蒲盆炎颗粒高、中、低剂量组大鼠病理综合评分显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）见表3及图1。

2.4 参蒲盆炎颗粒对苯酚胶浆诱导大鼠子宫内膜炎子宫组织NF-kB蛋白的影响 与正常组假手术组比较，模型组大鼠子宫组织p-核因子-κB p65蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，妇科千金胶囊、参蒲盆炎颗粒高、中剂量组、低剂量组大鼠子宫组织p-核因子-κB p65蛋白表达显著减少，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。

3 讨论

苯酚胶浆所致大鼠子宫内膜炎是慢性盆腔炎的一种病理改变，常用于评价中药防治慢性盆腔炎的疗效及机制[7]。本研究显示，苯酚胶浆诱导的大鼠慢性子宫内膜炎病理主要表现为宫壁宫腔扩张或粘连变小，黏膜固有层腺体减少或肌层与黏膜层分界不清，宫壁充血、水肿及炎细胞浸润，浸润的炎性细胞深达子宫肌层。参蒲盆炎颗粒应用后均有减轻子宫炎性反应及宫壁结构紊乱的作用，与模型组比较有显著性差异。结果提示，参蒲盆炎颗粒对苯酚胶浆致大鼠子宫内膜炎具有治疗作用。

炎性反应的损伤与氧自由基密切相关，SOD具有对抗机体氧化损伤作用[8]。在炎性反应形成发展的过程中，体内生成过多氧自由基，致使SOD活性下降，同时使线粒体膜受到损伤，此时，溶酶体释放出大量的炎性反应递质，从而出现了组织的炎性病变及疼痛[9]。本研究结果显示，参蒲盆炎颗粒通过调节SOD、MDA水平从而减轻炎性反应。并且显著降低了苯酚胶浆诱发的大鼠子宫内膜炎模型子宫组织IL-1β、TNF-α水平[10]。提示参蒲盆炎颗粒抑制炎性反应递质的产生，从而减轻子宫组织炎性反应细胞浸润。

核因子-κB信号通路在调节炎性反应和免疫反应中起重要作用，能够诱导一系列细胞因子和趋化因子的基因的转录[11]。本研究结果提示，参蒲盆炎颗粒可能通过抑制核因子-κB信号通路的激活而发挥抗炎作用。

综上所述，参蒲盆炎颗粒通过减轻炎细胞的过度浸润，调节SOD、MDA水平及抑制炎性反应递质TNF-α、IL-1β水平，从而抑制炎性反应。此外，参蒲盆炎颗粒抑制核因子-κB信号通路蛋白的磷酸化从而抑制炎性反应递质产生和释放而起抗炎作用。

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（2018-08-30收稿 责任编辑：张雄杰）