表型与分子药物敏感性试验对术后耐药骨关节结核患者化疗的指导与效果分析

盛杰 朱洋 地里下提·阿不力孜 唐伟 古甫丁 宋兴华

骨关节结核是由于结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)侵入骨和关节而引起的化脓性破坏病变，病变易累及脊柱及髋、膝等大关节。骨关节结核作为最常见的肺外结核，近年来发病数量不断攀升且面临耐药问题[1]。临床上普遍存在重手术、轻化疗的治疗理念，标准化、经验性的抗结核治疗方案导致耐药骨关节结核治疗失败、疾病复发等不良后果频发[2-3]。传统的表型药物敏感性试验(drug susceptibility test,DST)耗时较长，期间因无法准确判断病情而导致用药不当[4]。及时、准确的判断MTB及其耐药情况是指导临床早期开展个体化治疗、提高治愈率的重要措施[5]。本研究旨在根据表型及分子DST结果，对耐药骨关节结核患者术后进行早期个体化抗结核药品治疗并随访，探讨在DST结果指导下的个体化抗结核药品治疗方案的制定及疗效评价，以期为骨关节结核的规范治疗提供依据。

资料和方法

一、研究对象

连续选取新疆维吾尔自治区胸科医院骨科2018年3—12月接受病灶清除手术、经临床综合方法(临床表现、影像学、病理学结果均符合结核)诊断为骨关节结核的患者112例，其中脊柱结核76例，膝、髋关节结核26例，耻骨、髂骨结核10例；男46例，女66例，年龄4～83岁，中位年龄39.0岁。对术中标本同时采用BACTEC MGIT 960和MTBDRplus-分子线性探针技术(LPA)进行DST，两种技术联合共检出耐药患者23例。其中，男10例，女13例；年龄17～76岁，中位年龄41.0岁；初治患者6例，复治患者17例。

二、研究方法

取患者术中标本进行表型和分子DST检测，确定耐药患者及耐药谱，并实施个体化抗结核药品治疗及随访，具体方法如下。

1．标本采集及处理：术中采集病灶处的脓液、肉芽组织、死骨、干酪坏死组织。为避免标本含菌量不均匀、分割标本易污染等因素，将肉芽组织、死骨及干酪坏死组织剪碎加入无菌磷酸盐缓冲液研磨混匀备测，脓液标本采用N-乙酰左旋半胱氨酸-氢氧化钠前处理后再行检测。

2．分子DST检测：采用德国Hain Life Sciences公司生产的GenoType®MTBDRplus试剂盒，具体操作步骤参照试剂说明。扩增完成后将产物与探针试纸条进行杂交，根据显色结果进行是否耐药的判读。判读标准：27个反应条带中，所有野生条带均显色且突变条带均缺失时为敏感；野生条带缺失或突变条带显色为耐药。

3．表型DST检测：采用美国BD公司生产的BACTEC MGIT 960分枝杆菌培养监测系统及配套试剂，依据说明规范进行菌种鉴定及DST检测。以生长单位(growth unit,GU)指数评估耐药结果：含药品培养管的GU值<100为敏感，≥100为耐药。

4．个体化抗结核药品治疗方案的制定：术前未明确诊断为耐药骨关节结核的患者，在DST结果报告之前，初治患者采用标准化抗结核药品治疗方案：3H-R-E-Z/9-15H-R-E；复治患者根据患者病史分析复治原因，评估是否有耐药的可能性，依据既往治疗方案，采用经验性抗结核药品治疗方案。术前已明确诊断为耐药骨关节结核的复治患者，在DST结果报告之前采用既往已知的DST结果为患者制定个体化抗结核药品治疗方案。术后1～2 d，即可获取分子DST结果，根据结果重新评估并依据《WHO耐药结核病治疗指南(2016)》[6]和《耐药结核病化学治疗指南(2015)》[7]相关要求，由新疆维吾尔自治区胸科医院耐药结核病专家组结合患者分子DST结果、既往用药情况、年龄、并发症、相关药品的可及性、可行性和患者的耐受情况及依从性等临床实际情况进行综合讨论，在此基础上制定初步个体化抗结核药品治疗方案；待表型DST报告出具后，根据耐药谱进一步调整抗结核药品治疗方案。治疗周期一般为18～24个月，最终疗程根据随访情况确定。治疗过程中，密切对耐药骨关节结核患者实施随访和督导，观察药品效果及不良反应，动态、及时调整方案。

5．随访及相关判断标准：耐药患者术后每个月进行一次血常规、肝肾功能、血红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)复查；同时监测一般状况及药品不良反应。于术后1、3、6、12个月根据病变部位及类型选择性地安排X线、CT或MRI复查，观察植骨融合、脓肿及死骨吸收情况，判断疾病转归。采用Bridwell标准[8]评价植骨融合情况：Ⅰ级为骨块融合，重塑完全，骨小梁存在；Ⅱ级为骨块完整，骨块重塑不完全，无透亮区；Ⅲ级为骨块完整，但上方或下方存在透亮区；Ⅳ级为骨块塌陷，吸收，无骨性融合。采用疼痛视觉模拟评分(visual analogue scale，VAS)量表评估疼痛改善情况，量表总分为10 分，分值越高疼痛越严重：0分为无疼痛，1～3分、4～6分、7～9分、10分分别对应轻度疼痛、中度疼痛、重度疼痛、剧烈疼痛[9]。

6．临床疗效评价标准：随访时间为12个月，以“好转”为临床疗效评价指标[10]，具体为：耐药患者术后经个体化抗结核药品治疗≥12个月，并在术后12个月符合以下标准：(1)全身状况良好，无发热、盗汗等全身结核中毒症状，局部疼痛明显减轻；(2)ESR 及CRP较发病期明显降低，并持续多次复查逐渐趋于正常值范围；(3)X线、CT等影像学检查显示原植骨部位位置稳定，基本达骨性愈合，周围无异常阴影、新发病灶；(4)恢复基本活动和轻体力工作，无症状复发，无脓肿、窦道形成。

三、统计学处理

结 果

一、耐药骨关节结核患者基本情况

MTBDRplus-LPA的DST结果报告时间平均为(48.0±9.6) h，BACTEC MGIT 960 DST结果报告时间平均为(33.0±4.0) d。112例骨关节结核患者中，BACTEC MGIT 960 MTB培养阳性44例，对培养阳性标本进一步行表型 DST检测，检出利福平耐药18例，异烟肼耐药20例。以表型DST检测结果为参照标准，44例骨关节结核患者中，MTBDRplus-LPA检出利福平耐药21例，异烟肼耐药18例，与表型DST结果一致性较高，见表1。

表1 分子与表型DST利福平和异烟肼耐药性的检测结果比较

二、耐药骨关节结核患者术后个体化治疗方案

23例耐药骨关节结核患者术后均进行了个体化治疗，具体治疗方案见表2。

表2 23例耐药骨关节结核患者个体化药品治疗方案

三、预后随访及临床疗效分析

1．个体化治疗预后随访情况：23例耐药骨关节结核患者术后个体化治疗12个月，临床转归为：(1)好转21例，好转率为91.3%(21/23)，术后切口愈合时间为9～23 d，平均(14.05±3.65) d；(2)复发1例(例3患者)，患者因个体化治疗期间不规律服药，导致手术切口破溃，窦道形成；(3)失访1例(例6患者)。

2．个体化治疗前后病灶愈合情况：21例疗效评价为“好转”的耐药骨关节结核患者，术后12个月时，19例患者植骨达到Ⅰ级融合，2例患者达到Ⅱ级融合。植骨融合时间为4～10个月，平均(6.00±1.70)个月，植骨融合率为90.5%(19/21)，见图1～9。

图1～9 例17患者，女，29岁。临床诊断为初治腰4、5椎体结核，分子及表型DST结果均诊断为利福平和异烟肼耐药。图1～5为患者术前行CT及MRI检查的图像，箭示腰4、5椎体骨质破坏，相应椎体间隙变窄，病灶向后压迫脊髓，相应水平段发生继发性椎管狭窄，双侧腰大肌结核性脓肿形成；图6～9为患者末次随访CT复查及MRI图像，箭示腰椎序列良好，结核病灶清除彻底，植骨位置满意，植骨块融合，原脊髓受压部位压迫解除，椎管形态恢复正常，双侧腰大肌形态正常，无异常及混杂信号

3．个体化治疗前后ESR、CRP及VAS评分变化情况：21例疗效评价为“好转”的耐药骨关节结核患者术前ESR为19～101 mm/1 h，平均(62.62±26.52) mm/1 h；CRP为23.35～89.91 mg/L，平均(52.29±22.40) mg/L；VAS评分为5～9分，M(Q1,Q3)为7.0(6.0，7.5)分。经个体化抗结核药品治疗，各项指标呈逐渐下降趋势，总体差异有统计学意义(P=0.000)。术后12个月时ESR为5～19 mm/1 h，平均(14.39±5.24) mm/1 h，与术前比较差异有统计学意义(t=-8.25，P=0.000)；CRP为1.63～8.56 mg/L，平均(5.36±2.38) mg/L，与术前比较差异有统计学意义(t=-9.65，P=0.000)，21例患者ESR和CRP指标均已恢复至正常范围(表3)；术后12个月时VAS评分为0～1分，平均1.0(0.0，1.0)分，与术前评分差异有统计学意义(q=7.30，P=0.000)(表4)。

表3 个体化治疗前后不同检测时间21例耐药骨关节结核患者ESR和CRP的变化情况

表4 个体化治疗前后不同测评时间21例耐药骨关节结核患者的VAS评分变化情况

4．药品不良反应：主要为胃肠道反应和药物性肝损伤。23例患者在个体化抗结核药品治疗过程中，14例出现了胃肠道反应，其中12例轻症者调整用药频次并辅以心理干预，2例严重者给予护胃、调整用药剂量等对症治疗，14例患者均能坚持继续治疗。9例出现了药物性肝损伤，8例为一过性肝损伤，丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶高于正常值2倍以上并有消化道症状的患者给予口服联合静脉注射给药行护肝治疗后均有好转；1例患者丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶高于5倍正常值上限，护肝治疗效果差，考虑为吡嗪酰胺所致，停用后改为乙胺丁醇，肝功能逐渐恢复正常。

治疗方案中发生药品不良反应排名前三的药品分别为：利奈唑胺、阿米卡星、吡嗪酰胺。16例使用利奈唑胺的患者，12例分别出现头晕、头痛、肢体麻木、胃肠道不适及血小板降低等药品不良反应；症状较轻者予以对症治疗，如口服营养神经及保护胃黏膜药品对症治疗，症状较重者给予调整用药剂量及频次，症状均能缓解并继续治疗；其中血小板降低患者给予升血小板治疗，如仍持续大幅度降低需停用利奈唑胺而选择其他药品替代。16例使用阿米卡星的患者，10例分别出现注射部位疼痛、听力下降、头晕及肾功能损伤等不良反应，在调整治疗剂量、注射频次及给予口服营养神经药品等对症治疗后，症状均缓解。21例使用吡嗪酰胺治疗的患者，9例分别出现关节疼痛、肝功能损伤及过敏症状，除出现过敏症状的患者外，其余患者在对症治疗的同时均能持续用药。

讨 论

一、耐药骨关节结核患者术后个体化治疗疗效分析

骨关节结核临床症状不典型，患者发病后通常首诊于综合医院骨科，无论是实验室检测技术还是医疗专业水平，均无法保证患者能够得到规范、合理、全程的个体化抗结核治疗，导致骨关节结核患者复发、复治甚至继发性耐药。以营养支持为基础，彻底清除病灶的手术为保证，科学、规范的术后药品治疗是耐多药骨关节结核治疗成败的关键[1,11]。耐药骨关节结核使用标准化或经验性抗结核治疗方案很可能因方案中个别药品耐药而使疗效不佳甚至产生新型耐药。本研究结果显示，MTBDRplus-LPA检测利福平、异烟肼耐药性与表型DST结果一致率较高，但极大地缩短了报告时间，有助于早期、初步确定患者MTB耐药谱，有针对性地早期制定个体化抗结核药品治疗方案或药品不良反应调整方案，最大限度的保障患者用药安全[12]。

在分子及表型DST指导下，本研究23例耐药骨关节结核患者中，除失访及复发患者，其余21例患者术后经个体化抗结核治疗12个月，植骨融合率高达90.5%，VAS值较术前明显降低(P<0.01)，10例患者分值为0，疼痛症状完全消失，说明患者经手术及个体化治疗后，疼痛症状极大缓解；ESR和CRP水平较术前明显降低并趋于正常范围(P<0.01)，说明患者经个体化治疗后机体炎症感染程度逐渐降低。

二、DST指导下耐药骨关节结核患者个体化治疗方案的制定原则

新疆维吾尔自治区2015年耐药结核病监测结果显示：1803株MTB培养阳性的涂阳肺结核患者中，一线抗结核药品(异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素)总耐药率高达31.39% (566/1803)，耐药率排名前5位分别为异烟肼(13.03%)、链霉素(9.37%)、利福平(8.60%)、氧氟沙星(2.77%)和乙胺丁醇(0.39%)[13]。本研究通过对23例耐药骨关节结核患者个体化治疗及疗效随访，在《WHO耐药结核病治疗指南(2016)》的指导下，结合新疆结核病耐药基础数据及经济水平，探讨耐药骨关节结核在分子及表型药敏试验结果指导下，个体化抗结核药品治疗方案的制定原则，以期为本地区骨关节结核的规范治疗提供科学依据，具体原则如下：(1)单耐药和多耐药结核病患者尽量选用药敏试验结果敏感的一线抗结核药品。若敏感的一线抗结核药品无法与原方案敏感药品组成含4种药品的有效方案时，可以按照顺序依次从氟喹诺酮类药品、二线注射类药品中选择，直至组合成功。(2)耐多药、利福平耐药、准广泛耐药及广泛耐药结核病患者治疗方案一般从A组(一般建议选择较高代的本类药品)和B组中各选一种药品+C组中选用的两种药品+Z(常规加用)或D组药品。(3)避免在方案中同时选用2种同类药品，如阿米卡星和卷曲霉素。(4)避免使用与已知耐药药品具有双向交叉耐药的品种：如环丝氨酸和特立齐酮。

在临床实际诊疗过程中，WHO指南推荐的部分抗结核药品因新疆地区难以获得或无法持续供应、患者依从性差、药品治疗效果不理想、药品费用高造成患者负担重、药品不良反应大等因素未纳入本研究的个体化治疗方案。具体说明如下：卡那霉素、链霉素的耳毒性和肾毒性较大；加替沙星、乙硫异烟胺、特立齐酮、氨硫脲为本地区难以获得；贝达喹啉和德拉马尼为新药，国内应用较少，本地区难以获得；亚胺培南/西司他丁和美罗培南因使用方法为静脉滴注，患者无法长期坚持，且药品成本高、患者经济负担重；阿莫西林-克拉维酸钾治疗效果一般，氧氟沙星和环丙沙星治疗效果不理想。根据指南并结合本地区实际情况，本研究将利福平耐药结核病和耐多药结核病各组治疗药品筛选如下，以供本地区临床医师在实际治疗过程中参考。 A组：氟喹诺酮类，左氧氟沙星和莫西沙星；B组：二线注射类药品：阿米卡星和卷曲霉素；C组：二线口服类药品：丙硫异烟、环丝氨酸、利奈唑胺和氯法齐明；D组：吡嗪酰胺、乙胺丁醇、对氨基水杨酸异烟肼。

三、失访、复发原因及对策

本研究在术后个体化治疗随访过程中，出现失访及复发患者的可能原因为：(1)2例患者均来自经济发展水平不高、交通不便的偏远地区，且患者自身因疾病无法从事正常工作，导致经济水平下降，无法保证定期复查及规律治疗，其中失访患者原通讯信息失效且未定期复查，于术后第3个月失访；(2)受文化程度影响，患者对骨关节结核危害性认知不足，自我健康管理意识薄弱，症状缓解即自行停药；(3)治疗过程中，药品不良反应无法耐受，生活质量受到影响，造成患者减少用药剂量甚至自行停药；(4)受经济水平的影响，作为抗结核治疗基础的营养支持无法保证，导致机体免疫力下降。以上原因提示，临床医师需要在诊治及随访过程中不断做好对患者及家属的健康教育工作[14]，尽可能留存患者及家属多种通信方式，定期、主动随访、督促患者按时复查，对患者治疗期间产生的药品不良反应及时处理，提高患者用药依从性，规律完成疗程才能保证治疗成功[15]。

综上所述，在表型DST检测的基础上辅以分子DST检测，有利于个体化抗结核药品治疗方案的全面、快速制定，是尽早治愈耐药骨关节结核的重要因素。同时，本研究作为回顾性研究，因骨关节结核耐药患者术后抗结核药品进行治疗的周期较长，收集样本例数有限，目前仅随访至12个月，暂未获得患者18～24完成治疗后的最终疗效，存在一定的局限性。需开展前瞻性研究，进一步扩大样本量，并对耐药患者进行全程随访，方可对个体化治疗方案、治疗周期的合理性进行深入探讨。