脂肪氧化酶对玉米种子有关特性的影响

沈庆荣

摘 要：以玉米亲本565、409、410及其杂种后代409×565、410×565为材料，对自然越夏条件下玉米种子有关特性进行研究。结果表明：（1）根据Lox-1、Lox-2同时缺失的材料较耐储藏的研究结果，玉米亲本565属不耐储藏材料，亲本409、410及其杂种后代409×565和410×565属相对较耐储藏材料;（2）玉米杂种后代的Lox缺失∶不缺失≈1∶2，控制玉米耐储藏的脂肪氧化酶缺失为隐性遗传;（3）耐储藏材料（亲本409、410、杂种后代409×565和410×565）的发芽率和淀粉酶活性均显著高于不耐储藏亲本565高出很多，而MDA含量和脱氢酶活性则表现相反。

关键词：玉米;脂肪氧化酶;种子性状;影响

中图分类号 S513;O629.8文献标识码 A文章编号 1007-7731（2020）14-0028-03

作物种子是人类繁衍、生存和发展最根本的物质基础。种子的妥善保存为我国作物育种、生物工程及21世纪实现农业可持续发展提供了重要的物质保障[1]。玉米作为我国主要粮食作物，种植面积大，产量接近我国粮食总产量的1/3。但是玉米耐储藏性差，一旦储藏条件不适宜，极易陈化。种子陈化变质的机理众说纷呈，其中脂质过氧化被公认为是导致种子陈化变质的最主要因素，而脂肪氧化酶是脂质降解的关键酶[2]。

脂肪氧化酶是一种含非血红素铁的蛋白质[3]，专一催化具有顺顺—戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸的加氧反应，氧化生成共轭双键的氢过氧化物，其反应底物主要有亚油酸、亚麻酸及花生四烯酸等游离多元不饱和脂肪酸。脂肪氧化酶的同功酶主要有3种，分别为Lox-1、Lox-2、Lox-3，目前在水稻上存在并且在水稻耐储藏性、抗虫性等方面的作用均已得到了验证[2-4]。脂肪氧化酶的缺失可以中断脂质的氧化反应，减轻谷物的氧化变质，使谷物储藏不会因陈化变质作用而降低品质，保持谷物的清新气味。而玉米的脂肪含量通常在4%左右，极易酸败变质或遭病虫侵害，每年因陈化变质造成的损失高达数百亿元。脂质的降解是导致谷物储藏期间品质变劣、产生陈味的根源。笔者以玉米亲本565、409、410及其杂种后代409×565、410×565为材料，在自然越夏条件下对玉米种子的特性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料 試验材料由安徽科技学院玉米研究所提供，分别为玉米亲本565、409、410及其杂种后代409×565、410×565。

1.2 方法

1.2.1 材料处理 在自然条件下将玉米种子越夏储藏，试验时间设定在2018年10月。

1.2.2 脂肪氧化酶缺失测定 玉米取胚1粒（单粒测定），加入检测液2mL研磨，然后4000r/min离心10min，取上清液1mL倒入比色管，加入指示液3mL，放置4～30h（不同的同工酶显色时间不一致）后比色（对照上清液80℃水浴30min）。

1.2.3 不同老化处理时间发芽指标的测定 按照GB/T3543.4—1995技术规定[4]进行发芽实验，测定发芽率。选取直径1mm的沙砾作发芽床。将沙清洗消毒，取直径150mm的培养皿作发芽容器。先在培养皿中铺0.5cm厚沙，每个培养皿播50粒种子并覆1.5cm厚沙。沙子含水量在60%～80%（即100g干沙中加8～26mL水）。加盖培养皿盖，3次重复，然后置于发芽室中弱光条件下25℃、相对湿度80%恒温恒湿培养。当幼苗长至1cm左右时取下培养皿盖，然后每天定时用喷雾器补水1次，保持苗床含水量在60%～80%。

1.2.4 淀粉酶活性测定 根据《植物生理生化实验原理和技术》（王学奎主编，第2版）中的淀粉酶活性测定方法[5]进行测定计算，在540nm波长下比色，按式（1）计算：

式中：X为表上查得的麦芽糖含量（mg），VT为淀粉酶原液总体积（mL），VS为测定时取得酶液体积，W为样品质量，t为反应时间（min），N为样品稀释倍数。

1.2.5 丙二醛（MDA）含量测定 称取0.5g玉米叶，加5%三氯乙酸（TCA）5mL，研磨后所得匀浆在3000r/min离心10min。取上清液2mL，加0.67%硫代巴比妥酸（TBA）2mL，混合后在100℃水浴30min，冷却后再离心1次。分别测定上清液在450、532和600nm处的吸光度值，并按式（2）算出MDA浓度C（μmol/L），参照文献[6]方法测定。

式中：C为丙二醛的浓度，A450、A532、A600分别代表450、532和600nm波长下的吸光度值。

1.2.6 脱氢酶活性测定 参照胡晋（1986）TTC改进法[7]，将老化玉米种子萌发1d，剥下胚，每个样品10个完整胚，加入新鲜0.1% TTC溶液10mL摇匀，盖上塞子，置35℃温箱（黑暗）中染色3h，终止反应后蒸馏水冲洗3次，取出滤干后移入试管中，加入10mL 95%酒精于35℃温箱中浸提24h。测定490nm下的OD值

2 结果与分析

2.1 不同玉米亲本材料的耐储藏性 玉米中含有多种酶，其中脂肪氧化酶主要催化不饱和脂肪酸中含双顺式1，4—戊二烯结构。通过加入分子氧，生成各种过氧化物，直接影响玉米种子质量。前期研究表明：Lox-1，Lox-2同时缺失时材料较耐储藏，否则不耐储藏;Lox-3影响虫蚀率。由表1可以看出，亲本565的Lox-1、Lox-2表现不缺失，Lox-3表现缺失，可以判定属不耐储藏材料;亲本409和410表现一致，Lox-1、Lox-2同时缺失，Lox-3不缺失，属耐储藏品种。

2.2 不同玉米杂种后代脂肪氧化酶的遗传规律 脂肪氧化酶存在于多种禾本科植物中，其中自花授粉作物大豆、水稻脂肪氧化酶含有3种（Lox-1、Lox-2、Lox-3），分别由1对基因控制。3种同工酶存在分别由单个显性基因控制，而3种同工酶缺失分别由3个隐性等位基因控制[8]。由表2可以看出，脂肪氧化酶缺失试验测定结果显示，杂种后代409×565和410×565的Lox缺失∶不缺失≈1∶2，这可能是由于试验测定的群体较小以及玉米是异花授粉作物所造成的;其不同位点的缺失与否，是在不同波长的OD值与其对照相比较得出的（其中Lox-1、Lox-2是在432nm下比较得出的，Lox-3是在534nm下比较得出的）。由此可见，玉米脂肪氧化酶缺失属于一种隐性遗传。

2.3 不同玉米亲本及杂种后代的生化指标

2.3.1 发芽率 玉米在储藏过程中，内部会发生各种生理生化反应，进而影响其发芽率。发芽率的变化也反映了玉米在储藏过程中对逆境的抵抗能力，进一步反映了玉米能否耐储藏的生理特性。由表3可以看出，经过自然越夏储藏后，玉米亲本409、410、杂种后代409×565和410×565的发芽率高达78.3%、80.2%、77.2%和79.4%，不耐储藏的亲本565只有71.8%。耐储藏材料发芽率明显高于不耐储藏材料，结合2.2研究结果可以判断杂种后代409×565和410×565的储藏特性属较耐储藏。

2.3.2 淀粉酶活性 淀粉酶能够产生还原性糖，淀粉酶活性的大小与产生的还原糖量成正比，可用麦芽糖作标准曲线，用比色法测定淀粉酶生成的还原糖量，以单位质量的样品在一定时间内生成的还原糖量表示酶活力[5]。玉米种子的淀粉酶活力决定了种子活力，进而决定其耐储藏特性。由表3可知，经过自然越夏储藏后，玉米亲本409、410、杂种后代409×565和410×565的淀粉酶活性要比亲本565高得多，耐储藏材料的淀粉酶活性约为不耐储藏材料的5～6倍。

2.3.3 丙二醛含量 玉米种子在储藏过程中，膜质由于过氧化作用会导致其完整性遭到破坏[9]，导致电解质外渗。通过测定MDA含量可以衡量膜质过氧化水平。由表3可知，相对不耐储藏的亲本565而言，耐储藏的亲本材料409、410及杂种后代409×565和410×565的MDA含量很少，约为亲本565的1/3～1/2。由此可知，经过自然越夏后，耐储藏材料的膜质破坏程度较小，细胞物质外渗较少，膜受到的伤害较轻。

2.3.4 脱氢酶活性 脱氢酶活性是测定种子活力的重要指标，脱氢酶能准确快速地反映种子胚细胞的还原能力。氧化态的氯化三苯基四氮唑（TTC）接受了活种子呼吸过程中脱氢酶产生的氢，变成还原态的红色三苯基甲臜（TTC）。提取后定量测定，TTC含量愈高，脱氢酶活性愈强，种子活力愈高[9]。玉米种子是典型的淀粉性种子，活力很高，脱氢酶活性也很高。由表3可知，不耐储藏的材料亲本565的脱氢酶活性要比其他2份自交系和2份杂交种高出0.254～0.272个单位。种子活力的高低直接决定了储藏过程中的生理变化，活力越高则储藏越困难。由此可知，杂种后代409×565、410×565的储藏安全性相对较高。

3 结论与讨论

种子在储藏过程中会逐渐老化并最终丧失发芽能力，种子陈化是自然界的普遍现象，也是农业生产中的严重问题。本研究发现，Lox-1、Lox-2同时缺失的材料在储藏过程中具有较好的抗逆性，相对较耐储藏;耐储藏的亲本409、410、杂种后代409×565和410×565的发芽率和淀粉酶活性显著高于不耐储藏亲本565，而MDA含量和脱氢酶活性则表现相反;玉米杂种后代的Lox缺失∶不缺失≈1∶2，属隐性遗传，这与自花授粉作物水稻、大豆的研究结论相一致。但是玉米作为异花授粉作物，其种子基因纯合具有一定难度，而且品种间也存在较大差异，难以找到高度纯合的材料。前期研究结果也表明，不同的参试品种或品系种子存在较大差异，主要可能与玉米种子的纯合度有关。

参考文献

[1]陈新雄，陈小玲，陈叔平.低温库种质安全保存理论研究的进展[J].植物遗传资源科学，2001（2）：54-58.

[2]Wilson D O，McDonald M B.Tlipid eroxidation model of seed deterioration[J].Seed Science and Technology， 1986（14）：259-268.

[3]Loiseau J，Vu B L，Macherel M H，et al.Seed lipoxygenases：occurrence and functions[J].Seed Science Research， 2001（11）：199-211.

[4]畢辛华，戴心维.种子学[M].北京：中国农业出版社，2002：49，81-82，88.

[5] 王学奎.植物生理生化实验原理和技术[M].第2版.北京：高等教育出版社，2006.

[6]李合生.植物生理生化实验原理和技术[M].北京：高等教育出版社，1999.

[7]Hu J . Improvement of seed activity measurement-TTC quantitative method[J].Seed，1986（5-6）：71-72.

[8]吴跃进，吴敬德，张瑛，等.一种作物脂肪氧化酶同工酶快速检测技术[P].中华人民共和国知识产权（发明专利公报），2001，17（21）：53.

[9]Bewly，J. D. Black. M. Seeds. Physiology of Development Germinition[M]. New York，U.S.A.，1985.

（责编：徐世红）