基于网络药理学探讨金荞麦治疗慢性咽炎的作用机制

2020-08-06农达梅左华江吴春凤

中国民族民间医药·下半月 2020年5期

农达梅左华江吴春凤

【摘要】目的：通過网络药理学方法探究金荞麦治疗慢性咽炎的有效成分、关键靶点、相关通路信息。方法：利用中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP数据库检索，找出药物金荞麦的主要成分及作用靶点;利用人类基因组数据注释系统（Gene Cards）和联机孟德尔人类遗传数据库（OMIM）找出与疾病相关的作用靶点，将金荞麦的主要成分的作用靶点与慢性咽炎的相关靶点取交集，将交集靶点导入STRING数据库得到PPI网络，对该网络进行拓扑分析找出关键靶点，且通过Cytoscape3.7.0软件构建“药物-主要成分-疾病-作用靶点”网络图;把关键靶点导入DAVID数据库，找出金荞麦治疗慢性咽炎关键靶点参与的生物学过程、分子功能、细胞组分和KEGG通路。结果：通过TCMSP数据库的口服利用度（OB）和类药性（DL）条件筛选出15个金荞麦主要化合物，相应作用靶点100个;与慢性咽炎发病机制有关的作用靶点40个，经拓扑分析得到14个关键靶点;GO分析富集得到生物过程109个，分子功能30个，细胞组分9个，47条KEGG信号通路。结论：采用网络药理学的方法初步判断金荞麦治疗慢性咽炎是多成分-多靶点-多通路实现的，可进一步揭示金荞麦的药用价值。

【关键词】网络药理学;慢性咽炎;有效成分;药用价值

【中图分类号】R285 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2020）10-0044-07

Abstract：Objective To explore the information of active ingredients， key targets and related pathways of golden buckwheat in the treatment of chronic pharyngitis by network pharmacology. Methods The Chinese medicine system pharmacology database and analysis platform TCMSP database were used to find out the main components and target of the drug gold buckwheat; Using the Human Genome Data Annotation System （Gene Cards） and the Online Mendelian Human Genetic Database （OMIM） to find disease-related action targets， intersect the action targets of the main components of golden buckwheat with related targets of chronic pharyngitis， The intersection target is imported into the STRING database to obtain a PPI network， and the network is subjected to topology analysis to find key targets， and a “drug-main component-disease-acting target” network diagram is constructed by Cytoscape 3.7.0 software; The key targets were imported into the DAVID database， and the biological processes， molecular functions， cellular components， and KEGG pathways involved in the key targets of golden buckwheat for chronic pharyngitis were found.Results According to the oral availability （OB） and drug-like （DL） conditions of the TCMSP database，15 major buckwheat compounds were screened out， corresponding to 100 targets; 40 targets were related to the pathogenesis of chronic pharyngitis. Fourteen key targets were obtained by analysis; 109 biological processes， 30 molecular functions， 9 cellular components， and 47 KEGG signaling pathways were obtained by GO analysis and enrichment. Conclusion Using network pharmacology method to preliminarily judge that the treatment of chronic pharyngitis by golden buckwheat is realized by multi-component-multi-target-multi-path， which can further reveal the medicinal value of golden buckwheat.

Keywords：Network Pharmacology; Chronic Pharyngitis; Active Ingredients; Medicinal Value

咽炎在现代临床医学中作为一种常见的疾病。从相关病理和临床症状上，可以将咽炎划分为慢性类与急性类，其中慢性咽炎是咽黏膜和淋巴组织的慢性炎症疾病[1]，经常也属于人体上呼吸道感染的慢性炎症的一些表现。慢性咽炎一些主要症状表现为咽干、咽疼、咽痒、异物感、烧灼感、微痛、恶心、影响睡眠及影响日常生活等[2]。长期患咽炎的大众，不加以治疗，严重影响人的生活质量。

金荞麦（Fagopyrum dibotrys Hara）为蓼科荞麦属植物金荞麦的根茎，其根茎为常用中药材，是一种营养丰富并具有重要价值的药资源植。金荞麦别名野荞麦、苦荞头、金锁开银等，在我国的四川、江西、江苏等地都有分布。其性凉，味辛涩，归肺经，具有清热解毒、排脓祛瘀功效，常用于咽喉肿痛、肺热咳嗽、乳蛾肿痛、头风痛、消化不良、肝炎腹胀等病症[3]。现代药理学研究证实，金荞麦有显著的抗癌、抑制肿瘤细胞肺侵袭和转移的作用，此外还具有消炎抗菌、抗衰老、抗氧化酶活性解热抗炎、祛痰镇咳、抗血小板聚集、抗突变、以抵抗自由基的降血糖、血脂作用以及提高免疫力等药理作用[4-6]。赵炎军[7]在研究中认为金荞麦提取物具有一定的体外抗流感病毒作用。本研究利用网络学药理方法，从“藥物-化合物-作用靶点-疾病”复杂网状结构探究金荞麦治疗慢性咽炎的关键作用靶点、分子生物学过程、信号通路等。以金荞麦治疗慢性咽炎的基础研究提供参考思路。

1 方法

1.1 获取金荞麦主要化学成分及作用靶点利用TCMSP（http：//tcmspw.com/）数据库找出金荞麦所有的化学成分，以口服利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18作为条件筛选主要有效成分，根据DrugBank数据库获取主要化学成分的预测靶点，并将化合物靶标蛋白逐一输入String、UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）检索以剔除重复、非人源的靶点，逐一转化为主要活性化合物规范的靶点蛋白的基因标识符（Gene Symbol）。

1.2 筛选慢性咽炎的相关靶点及潜在作用靶点 Gene Cards数据库克服了上百个数据库自身格式的局限，整理归纳了基因表达、功能、位置、通路、变异、同源基因、疾病和相关参考文献等各种信息，收集整理了上百个网站的内容，并将它们合理地系统地整合到一起。OMIM数据库涵概关于人类遗传病和基因座位等相关信息、和文献的中心级数据库。通过以上两个数据，筛选了有关慢性咽炎的靶点1272个。将上述1.1药物主要化学成分的预测靶点与疾病相关靶点导入Venney2.1分析平台，取交集靶点，获得潜在作用靶点。

1.3 金荞麦化合物-疾病靶点及靶点互作网络图的构建将筛选过后的主要化学成分与交集的潜在作用靶点输入到Cytoscape3.7.0软件，构建“药物-主要成分-疾病-靶点”网络，进行拓扑学分析。同时将筛选得到的共有靶点导入String平台（http：//string-db.org），将Organism设定为“Homo aspiens”，最小交互分数取0.4，得到靶点互作的（PPI）网络模型。由于STRING数据库无法直观的看出靶蛋白的Degree变化，故将STRING的蛋白互作信息保存为TSV格式并导入Cytoscape3.7.0软件中采用Analyze network工具进行可视化分析，筛选出关键靶点。

1.4 关键靶点GO富集分析及相关信号通路注释分析为进一步了解上述筛选出的关键靶点的功能及相关信号通路的作用，将上述1.3的得到的关键靶点导入DAVID6.8数据平台进行GO（Gene Ontology）生物学过程富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes Genomes）信号通路富集分析，设置靶基因名称为人类进行筛选，将所有靶基因名称校正为官方名称（office gene symbol），通过设定阈值P<0.01，得到生物学过程、分子功能、细分和相关通路分析结果，并利用Origin7.5软件将其结果可视化。

2 结果

2.1 金荞麦主要化学成分的筛选、收集通过TCMSP平台数据库检索“金荞麦”，总化合物为45种，以OB ≥30%，DL≥0.18为筛选条件选出15个潜在治疗作用的活性化学成分，见表1。15个活性化合物共有100个作用靶点。

2.2 共有靶点的收取将金荞麦潜在活性化合物的作用靶点与Gene Cards数据库及OMIM数据库检索出的慢性咽炎疾病靶点在Venney2.1平台做韦恩图，交集靶点40个，可认这40个靶点是金荞麦治疗慢性咽炎的主要靶点，如图1。

2.3 PPI网络图构建将金荞麦治疗慢性咽炎的40个主要靶点导入STRING数据库，得到治疗靶点的PPI网络，通过Cytoscape进行可视化。由图2可知，线条表示靶点与靶点之间相互作用关系。该网络由260条边组成一个完整的蛋白网络互作图。该图中圆形的大小和颜色，从浅色圆形到深色椭圆形，形状越来越大，颜色逐渐加深，表明Degree度值增大。PPI蛋白互作关系具体见表2（仅列出前20个靶点）。由表2可知，靶点平均Degree为13，Average Shortest Path Length（平均最短路径长度）在1.3到2.8之间，网络中节点的Closeness Centrality（连通度）、Betweenness Centrality（介数中心性）曲线接近于幂律分布，其中节点度值越大的节点，平均最短路径长度越短的节点，表明该节点与慢性咽炎的相关性越大，治疗慢性咽炎的可能性最大。超过靶点平均Degree的靶点有14个，可认为这14个靶点为关键靶点。

2.4 金荞麦化合物-疾病靶点构建分析从图3可知，金荞麦化合物-疾病靶点网络共有57个节点，127条边，包含了1种药物、1种疾病、15个化合物、40个靶点，其中蓝色棱形为药物，红色椭圆形为疾病，黄色长方形为化合物，绿色三角形为靶点。从度值大小上来看，排名前4位为quercetin（槲皮素）、luteolin（木犀草素）、β-sitosterol （β-谷甾醇）、isorhamnetin（异鼠李素），节点分别为34、17、8、5，这些化合物成分在治疗慢性咽炎发挥着重要作用。

2.5 相关通路信息和注释分析为了进一步阐明金荞麦活性成分的作用机制，将上述2.2预测得到的14关键靶蛋白导入DAVID数据平台（https：//david.ncifcrf.gov）GO富集分析，得出148条目，其中包括生物学过程109条，分子功能30条，细胞组分9条，KEGG分析得到47条KEGG信号通路。经Bonferroni校正P<0.01，符合条件的有生物学过程为46条，分别为凋亡过程的负调控（negative regulation of apoptotic process）、药物反应（response to drug）、上皮细胞增殖的阳性调节（positive regulation of epithelial cell proliferation）、细胞对白细胞介素-1的反应（cellular response to interleukin-1）、基因表达阳性调节（positive regulation of gene expression）等，见图4。取P<0.01，符合条件的分子功能有15条，为酶绑定（enzyme binding）、蛋白质异二聚化活动（rotein heterodimerization activity）、轉录激活子活性，RNA聚合酶II核心启动子近端区序列特异性结合（transcriptional activator activity， RNA polymerase II core promoter proximal region sequence-specific binding）、转录因子绑定（transcription factor binding）等，见图5。取P<0.01，符合条件的细胞组分有核质（nucleoplasm）、细胞质（cytoplasm）、核（nucleus）、膜（membrane）和膜筏（membrane raft），见图6。取P<0.01得到31条信号通路，包括蛋白聚糖在癌症（Proteoglycans in cancer）、通路在癌症（Pathways in cancer）、膀胱癌（Bladder cancer）、小分子核糖核酸在癌症（MicroRNAs in cancer）、HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）等，见图7。大量的靶蛋白富集在这些注释和信号通路上，通过-log（p）值显现富集相关性大小，p越小，-log（p）值越大，则与疾病相关可能性越大。通过生物学过程、分子功能、细胞组分、相关信号通路来预测慢性咽炎，达到治疗的目的。

3 讨论

慢性咽炎（Chronic Pharyngitis）是一种咽喉部黏膜、黏膜下组织及淋巴组织产生的慢性炎症，主要患病人群为青壮年。慢性咽炎治疗起来病程较长，且症状容易反复发作[8]。根据流行病学显示，我国慢性咽炎一直存在着较高的发病率，特别是在空气质量较差的大城市，给众多患者带来烦恼和负担，且较多的医疗资源用于治疗咽炎。而引起咽炎的原因非常多，有慢性感染因素和非感染因素。前者为细菌类感染、菌群紊乱、鼻炎类;后者为职业性暴露、生活习惯及生活环境等[9]。慢性咽炎属于传统医学“喉痹”范畴，在《素问·阴阳别论》[10]中提出咽喉者为阴阳升降之路，喉痹之病机主要是人体出现阴阳失衡。而中药金荞麦具有多成分、多靶点、多通路协同作用的特点，通过多途径发挥直接或间接抗病菌、抗病毒治疗慢性咽炎的作用。现市场上金荞麦片联合莲花清瘟胶囊可起到缓解甲型H1N1流感、咽喉肿痛作用。金荞麦也可作单味药单独使用，具有抗炎、祛痰镇咳的功效，是治疗慢性咽炎的有效药物，但相关报道较少。

本研究通过筛选得到的15种活性成分，主要是黄酮类、甾体、有机酸等化学成分，其中最有意义的是黄酮类，为主要的药理活性成分[11]。具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和提高机体免疫力等多种药理学功效。从抗炎的角度探究，槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、异鼠李素对慢性咽炎的治疗作用。刘涛等[12]在研究中表明了槲皮素、木犀草素对小鼠镇痛、抗炎、镇咳、祛痰的作用及对家兔的慢性咽炎治疗作用。倪湾[13]阐述槲皮素的抗炎活性可通过NF-kB和Akt信号通路调节炎症因子影响。研究发现，异鼠李素具有抗炎、抗病毒、抗氧化等作用，抗炎主要是通过抑制脂多糖（LPS）诱导的TNF-α，IL-1β和IL-6在体外和体内的分泌[14]。β-谷甾醇大多数存在于植物细胞膜中，其抗炎主要机制是对脂多糖诱导巨噬细胞，提高抗炎因子（IL-10）的活性[15]，β-谷甾醇临床上常用于降低胆固醇。

金荞麦治疗慢性咽炎主要靶点为EGFR、CASP3、ESR1、MYC、IL6等14个。其中EGFR的变化代表慢性咽炎患者的病变水平，在孙恒[16]的研究中表明了血清EGFR的检测在鼻咽癌患者临床诊治中的重要意义。CASP3作为半胱氨酸蛋白酶族的重要成员，可以通过细胞凋亡有序级联反应[17]。MYC的过度表达是人类癌症特征重要的一个特征，认为MYC癌基因通过转录因子，解除大量特定靶蛋白表达的调控，可以通过预测咽炎转化为咽炎癌类型癌症。

经过GO分析和KEGG分析发现，可以发现金荞麦的有效化合物能作用于多个位点。如EGFR、CASP3、IL6、MCL1、RELA、 VEGFA、MDM2、MYC参与凋亡过程的负调控的生物学过程;PGR、EGFR、 CCND1、 HIF1A、ESR1、MDM2参与分子功能中酶绑定;PGR、CASP3、CCND1、HIF1A、MCL1、RELA、ESR1、MDM2、MYC参与细胞组分中核质的相关活动;EGFR、CASP3、CCND1、HIF1A、ERBB2、VEGFA、ESR1、MDM2、MYC靶蛋白涉及在蛋白聚糖在癌症通路上。

综上所述，网络药理学作为一种中药研究的方法，研究了金荞麦治疗慢性咽炎的潜在作用机制，从而阐明了金荞麦治疗慢性咽炎有效成分与作用靶点及信号通路，并明确了金荞麦通过多种活性成分、潜在作用靶点、各种生物学过程及信号通路发挥治疗慢性咽炎的的作用机制，这为金荞麦在慢性咽炎的治疗中提供重要的参考价值。参考文献

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