能谱CT评价贝伐单抗抗大鼠C6胶质瘤血管生成效果

韩 蕾，黄晓宇，刘显旺，邓亚军，柯晓艾，周 青，周俊林

(兰州大学第二医院放射科 兰州大学第二临床医学院 甘肃省医学影像重点实验室，甘肃 兰州 730030)

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见原发性肿瘤之一，患者中位生存期仅14.6个月[1]。恶性胶质瘤发病率及死亡率均高，严重危害人类健康与生命安全[2-3]。研究[4-5]表明肿瘤的发生发展依赖于新生血管生成，而此过程受血管相关标志物的驱动。抗血管生成药物是近年来抗肿瘤研究的热点之一，如何在治疗过程动态评价药物治疗效果是目前临床面临的紧要问题，寻找能够无创、动态监测抗脑胶质瘤血管生成药物疗效的方法非常重要。能谱CT已广泛用于临床，可采用有效原子序数、单能量CT值、能谱曲线及物质分离技术量化检测病灶的组织结构和功能状态。本研究探讨能谱CT定量参数评估贝伐单抗抗大鼠C6脑胶质瘤血管生成疗效的可行性及其价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料与处理 30只Sprague Dawley雄性大鼠，SPF级，12周龄，体质量180～230 g,平均(201±16)g，购于中国农业科学院兰州兽医研究所，许可证编号：SYXK(甘)2018-0003。C6细胞株购自齐氏生物科技原代细胞生物制药,于37、5% CO2恒温培养箱培养，培养基为含10%胎牛血清的DMEM培养基(美国GIBCO公司)，隔天换液，通常传至2～3代。待细胞处于对数生长期时以10%胰酶消化3～5 min，之后计数、离心，加入不含血清的培养基，以Hanks液冲洗吹打，形成细胞悬液，调整浓度至1×106/ml～1×108/ml备用。

1.2 动物建模与分组 向大鼠颅内注射C6细胞悬液建立脑胶质瘤模型。以2%戊巴比妥麻醉大鼠，头部固定于脑立体定位仪，暴露颅骨前囟门，以颅骨矢状缝右侧旁开4 mm、冠状缝前1 mm处为进针点，采用10 μl微量进样器抽取C6胶质瘤细胞悬液10 μl，以1 μl/min速度注入，注射完毕针头停留5 min后垂直拔针，以骨蜡封闭针后缝合、消毒术区。造模2周后(用药前)行能谱CT观察成瘤情况，并随机分为实验组和对照组，每日分别腹腔注射贝伐单抗注射液5 mg/kg体质量及同等剂量浓度0.9%生理盐水，连续注射1周。

1.3 仪器与方法 采用GE Discovery HD 750能谱CT仪，分别于用药前及用药4、8天对所有大鼠行颅脑CT扫描。麻醉大鼠后保定于CT扫描床进行扫描，扫描参数：轴扫模式，探测器宽度20 mm，扫描视野Small Head，显示视野9 cm，球管转速0.5 r/s，管电压80/140 kV瞬时切换，层厚0.625 mm；以流率0.2 ml/s注入对比剂碘海醇(300 mgI/ml) 2.5 ml/kg体质量后行增强扫描，延迟时间30 s。采用标准模式重建算法、30%自适应统计迭代重建算法对图像进行重建。由2名具有15年神经影像学诊断经验的主任医师独立分析图像，于3个不同层面瘤体实质区尽量避开肿瘤囊变坏死区域勾画3个直径为0.5 mm的圆形ROI，测量能谱CT定量参数[40～140 keV单能量CT值、碘(水)含量]，取其均值为最后结果。记录2组肿瘤体积。

1.4 病理学检查 每次能谱CT扫描结束后分别于2组随机各选3只大鼠，行心脏灌流后处死，取全脑组织，经常规固定、脱水、石蜡包埋等处理后行HE染色及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)染色。由2名具有15年工作经验的病理科主任医师遵循盲法原则独立分析，并检测阳性细胞(细胞核深染为深棕色)数量，以2者测量结果的均值为最后结果。每次染色均设立阴性和阳性对照。

1.5 统计学分析 采用SPSS 23.0统计分析软件。计量资料以±s表示，计数资料以百分比表示。采用独立样本t检验比较2组能谱CT定量参数的差异。以Kappa检验分析2名病理科医师检测VEGF结果的一致性，Kappa≤0.20为一致性较差，0.20

2 结果

2.1 大鼠C6胶质瘤模型能谱CT影像学表现 30只大鼠中，2只未见成瘤，2只完成用药前扫描后意外死亡，最终实验组及对照组各13只大鼠纳入研究。实验组用药前、用药4、8天肿瘤体积分别约(84.28±13.52)、(80.80±12.12)及(77.25±4.12)mm3；对照组分别约(83.33±14.65)、(99.82±13.15)、(113.25±20.52)mm3；不同时间点实验组增强后瘤体实性成分均明显强化，中心坏死区无强化；对照组增强后瘤体边缘明显强化，中心坏死区强化程度减低，见图1。

图1 2组大鼠不同时间点脑胶质瘤能谱CT图像 A.实验组用药前； B.实验组用药4天； C.实验组用药8天； D.对照组用药前； E.对照组用药4天； F.对照组用药8天

2.2 能谱CT各定量参数 2组用药前70 keV单能量CT值及碘浓度差异无统计学意义(P均>0.05)。实验组用药4、8天70 keV单能量CT值及碘浓度均低于对照组(P均<0.05)，见表1。

表1 2组不同时间点能谱CT各定量参数值比较(±s)

表1 2组不同时间点能谱CT各定量参数值比较(±s)

组别用药前n70 keV单能量CT值(HU)碘浓度(mg/cm3)用药4天n70 keV单能量CT值(HU)碘浓度(mg/cm3)用药8天n70 keV单能量CT值(HU)碘浓度(mg/cm3)实验组1385.97±9.0417.48±2.071080.58±5.5711.91±3.23775.51±5.429.51±1.36对照组1381.35±9.9818.21±1.431090.77±9.6722.32±5.35792.08±7.4227.12±5.06t值-1.35-0.99--3.56-6.42--6.43-13.01P值-0.180.33-<0.05<0.05-<0.05<0.05

2.3 病理学检查 2名医师检测VEGF结果的一致性较强(Kappa=0.61，P<0.05)。用药前2组光镜下均见肿瘤实性区瘤细胞排列密集，形态不规则，细胞核大，深染，核浆比例增大；随用药时间延长，实验组瘤内逐渐出现小点状或小斑片状坏死区域，肿瘤细胞排列相对松散，细胞结构塌陷，坏死区周围可见炎性细胞浸润；对照组肿瘤组织坏死区域相对较少。VEGF检测结果：用药前实验组(45.40%)和对照组(46.50%)阳性细胞百分比差异无统计学意义(P=0.11)，用药4、8天实验组阳性细胞百分比(33.93%、25.00%)均低于对照组(53.28%、63.80%，P均<0.05)，见图2。

图2 2组不同时间点脑组织VEGF免疫组织化学染色(×200) A.实验组用药前； B.实验组用药4天； C.实验组用药8天； D.对照组用药前； E.对照组用药4天； F.对照组用药8天

2.4 能谱CT各定量参数与免疫组织化学结果的相关性 随着观察时间延长，实验组70 keV单能量CT值、碘浓度逐渐降低，对照组70 keV单能量CT值、碘浓度逐渐增高；2组不同时间点70 keV单能量CT值、碘浓度值均与VEGF呈正相关,见表2。

表2 不同时间点能谱CT各定量参数与VEGF结果的相关性分析结果

3 讨论

新生血管形成是胶质瘤的特征性表现之一。肿瘤细胞分裂、增殖及远处转移均依赖于新生血管[6]，后者与患者预后密切相关[7]。新生血管生成是药物治疗的重要靶点，目前已成为研究热点。VEGF是一种重要的血管生成影响因子，在胶质瘤中呈高表达[8-9]，其表达量越高，肿瘤恶性程度越高。研究[10-11]表明施加抗血管生成药物靶向治疗一定时间后肿瘤组织新生血管减少，改善组织氧化作用，相应亦会改善肿瘤微环境，增强放射治疗及化学治疗疗效；而如何在药物治疗过程中动态观察药疗效则是临床中亟待解决的问题。

能谱CT通过有效原子序数、单能量CT值、能谱曲线及物质分离技术量化检测病灶的组织结构和功能状态，提高病灶对比度及检出率[12]。研究[13]表明能谱CT定量参数可评估大鼠C6胶质瘤新生血管形成。TANG等[14]比较62例腹部传统CT与能谱CT图像，发现单能量CT为50～70 keV时图像对比信噪比最佳，显示胃结肠韧带最清晰。本研究基于26只SD大鼠能谱CT图像绘制最佳对比噪声比曲线，均在70 keV单能量图像获得较好的对比噪声比，故将70 keV单能量成像确定为显示肿瘤与瘤周组织的最佳单能量图像。

贝伐单克隆抗体是重组人源性VEGF单克隆IgG1抗体[15]，通过与VEGF-A结合而竞争性抑制其与细胞表面相应血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)的结合，进而抑制肿瘤血管生成。本研究中实验组经抗血管生成药物贝伐单抗治疗后70 keV单能量CT值、碘浓度均下降；用药4、8天实验组70 keV单能量CT值、碘浓度均低于对照组，VEGF阳性细胞数较对照组明显减少；分析原因，中枢神经系统胶质瘤VEGF-A过量表达，肿瘤内部存在大量新生血管，而新生血管越多，微血管密度越高，肿瘤强化程度越强，病灶内碘含量就越多，相应单能量CT值及碘浓度就越高，贝伐单抗药物竞争性抑制VEGF与细胞表面VEGFR相结合，导致VEGF表达量降低，新生血管生成受到抑制，相应单能量CT值及碘浓度降低。

综上所述，能谱CT定量参数70 keV单能量CT值及碘浓度可无创、动态评估贝伐单抗抗大鼠C6脑胶质瘤血管生成疗效，有望成为评价抗肿瘤血管生成药物疗效的新方法。本研究的主要局限性：①样本量少；②CT软组织分辨率较低，难以清晰显示肿瘤内部细微结构，可能导致ROI中包含微囊变区域；③肿瘤体积较小，勾画ROI难免受到容积效应的影响。