贝母多糖大孔吸附树脂纯化损失率研究

2020-08-04陈品顾欣陈珍瑶阎怡平廖芸张华

安徽农业科学 2020年14期

陈品顾欣陈珍瑶阎怡平廖芸张华

摘要以甘孜川贝母为研究对象，考察单因素（流速、洗脱液体积、上样体积）和正交试验中AB-8 型大孔吸附树脂对纯化甘孜川贝母多糖损失率的影响，采用硫酸蒽酮法测定多糖含量。结果表明，流速、洗脱液体积、上样体积对甘孜川贝母多糖提取率均有影响，影响效果的因素从大到小依次为流速、上样体积、洗脱液体积。甘孜川贝母多糖纯化损失率最低的最优条件为流速1 mL/min、上样体积4 BV、洗脱液体积为4 BV。可见该优化条件下，甘孜川贝母多糖纯化损失率降低，提取率明显提高。

关键词甘孜川贝母多糖;大孔吸附树脂;纯化;损失率

中图分类号 R284 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）14-0173-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.14.048

Abstract Ganzi Fritillaria was the research object.The single factors （flow rate，elution volume and sample volume） and the orthogonal experiment of polysaccharide purified by the AB-8 macroporous absorption resin were researched.The polysaccharide content was determined by anthrone-sulfate method.The results showed that flow rate，eluent volume and sample volume all had an effect on the extraction rate of Ganzi Fritillaria polysaccharides.The influencing order from high to low was the flow rate，sample volume and elution volume.The optimal purification condition with the lowest loss ratio of polysaccharide was 1 mL/min flow rate，4 BV elution volume and 4 BVsample volume.Therefore，under this optimal purification condition，the purification loss ratio of Ganzi Fritillaria is reduced，and the extraction rate is significantly improved.

Key words Ganzi Fritillaria polysaccharide;Macroporous absorption resin;Purification;Loss ratio

貝母为百合科（Liliaceae）贝母属（Fritillaria）植物的干燥鳞茎，具有止咳化痰、清热润肺之功效[1]。多糖是贝母中的有效活性成分之一，研究表明多糖具有多种生物活性，而且因其在使用过程中没有任何毒副作用，所以多糖已经成为绿色食品添加剂、功能保健品及新药研发等新的研究对象[2-3]。大孔吸附树脂由于受到自身的范德华力或氢键的作用，从而产生吸附性，是一种不含交换基团的大孔结构的高分子吸附剂[4]，其对多糖的纯化具有显著的效果。但是大孔吸附树脂对多糖的提取纯化方法多种多样，对多糖的提取率也存在差异，导致对多糖的提取率不能得到保证。张华等[5]在贝母粗多糖的4种类型树脂纯化试验中，显示贝母多糖提取率较低。为此该试验以甘孜川贝母为研究材料，用水提醇沉的方法提取粗多糖并用大孔吸附树脂纯化多糖，研究单因素和正交优化设计试验中大孔吸附树脂纯化甘孜川贝母多糖时对其损失率的影响，旨在提高贝母纯化多糖的提取率，为贝母多糖相关功能产品的开发与利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试材甘孜川贝母，购买于四川省南充市嘉陵区四川农货特产直销店;乙醇、盐酸、硫酸、氯仿，重庆川东化工集团有限公司;氢氧化钠，四川西陇化工有限公司;正丁醇，成都市科龙化工试剂厂;蒽酮，中国试剂网-上海市宁波路54号;无水葡萄糖对照品，成都市新都区木兰镇工业开发区;AB-8型大孔吸附树脂，东鸿化工有限公司。

1.2 仪器 FW80型高速试样粉碎机，河北省黄市新兴电器厂;zxfd-5250十段编程鼓风干燥箱，上海智城分析仪器制造有限公司;722型可见分光光度计，上海欣茂仪器有限公司;FA1004型号电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司;HH.S 精密恒温水浴锅，江苏金坛市医疗仪器厂;往复式水浴恒温摇床，上海智城分析仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 甘孜川贝母粗多糖提取。参考姜峻等[6]的方法，将甘孜川贝母干燥样品用粉碎机将其打成粉末，过60目筛;称取25 g甘孜川贝母粉末，加入石油醚125 mL回流提取2 h脱脂，取出后过滤取滤渣，放置于烘箱中24 h。称取20.0 g甘孜川贝母样品加入蒸馏水，定容至200 mL，放于80 ℃水浴锅中1 h，用离心机在3 800 r/min离心10 min，过滤取上清液。过滤后的滤渣按照同样步骤再提取3次。将3次的滤液合并，在80 ℃水浴锅中浓缩，直到达到其原体积1/3，立即加入无水乙醇，直到达到浓缩液体积的3～4倍，放入4 ℃冰箱进行醇沉24 h。醇沉后取其沉淀，加入蒸馏水溶解沉淀，加入1/3倍体积Sevage试剂（氯仿∶正丁醇=5∶1， V/V ）振荡2 min，之后以3 000 r/min 离心10 min，取粗多糖水溶液，定容至100 mL，得甘孜川贝母粗多糖提取液，置于4 ℃保存备用。

1.3.2 单因素对甘孜川贝母粗多糖大孔吸附树脂纯化损失率的影响。

1.3.2.1 大孔吸附树脂的预处理。使用蒸馏水反复冲洗AB-8大孔吸附树脂以去除表面杂质，直到大孔吸附树脂无法冲洗出泡沫为止;再将大孔吸附树脂放入无水乙醇中浸泡24 h，接着将大孔吸附树脂用无水乙醇冲洗，直到溶液不再呈现白色浑浊状态为止，再用蒸馏水冲洗大孔吸附树脂直到溶液无乙醇味;用5% HCl溶液冲洗大孔吸附树脂直到流出的溶液呈酸性后停止，再放置于5%的HCl溶液中浸泡4 h，接着用蒸馏水冲洗至中性，最后用2%NaOH溶液冲洗大孔吸附树脂直到流出溶液呈碱性后停止，再放置于5%的HCl溶液中浸泡4 h，接着用蒸馏水冲洗至中性，最后将大孔吸附树脂浸泡于蒸馏水中，于4 ℃保存备用[7]。

1.3.2.2 流速对甘孜川贝母多糖纯化损失率的影响。直接取“1.3.1”方法制得的粗多糖溶液3 BV上柱，用3 BV乙醇洗脱，按照1、2、3、4、5 mL/min 的流速洗脱，收集洗脱液;之后在洗脱液中加80%乙醇醇沉24 h，3 000 r/min 离心10 min得沉淀，复溶测定多糖含量[8]。

1.3.2.3 上样体积对甘孜川贝母多糖纯化损失率的影响。分别取不同柱体积粗多糖溶液（1、2、3、4、5 BV）上柱，用3 BV乙醇洗脱，按照3.0 mL/min 的流速洗脱，收集洗脱液;之后在洗脱液中加80%乙醇醇沉24 h，3 000 r/min离心10 min得沉淀，复溶测定多糖含量[9]。

1.3.2.4 洗脱液体积对甘孜川贝母多糖纯化损失率的影响。直接取“1.3.1”方法制得的粗多糖溶液3 BV上柱，用不同柱体积的乙醇（1、2、3、4、5 BV）洗脱，按照3.0 mL/min 的流速洗脱，收集洗脱液;之后在洗脱液中加80%乙醇醇沉24 h，3 000 r/min离心10 min得沉淀，复溶测定多糖含量[10]。

1.3.3 甘孜川贝母多糖纯化正交试验。在单因素试验的基础上，根据选出的3个合适水平进行正交试验。考察流速（A）、上样液体积（B）、洗脱液体积（C）对多糖损失率的影響。正交试验的设计方案见表1。

1.3.4 多糖损失率计算。

1.3.4.1 葡萄糖标准曲线的绘制。取0.10 mg/mL的葡萄糖标准溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL分别置于10 mL 具塞试管中，分别加入蒸馏水至2 mL，试管在冰水中冷却，同时沿试管壁加入蒽酮溶液（0.2 g蒽酮加入100 mL浓硫酸）5 mL后进行摇匀，将摇匀后试管放入100 ℃的水浴锅中加热10 min，取出后立刻将试管放在冰水中冷却5 min，取出试管并在室温中平衡10 min。在620 nm波长处测定溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.4.2 多糖损失率计算。将纯化前和纯化后甘孜川贝母多糖溶液均稀释10倍，分别取稀释后的多糖样品溶液2 mL，试管在冰水中冷却，后续步骤同“1.3.4.1”[11]。将测定的该多糖溶液吸光度带入葡萄糖溶液标准曲线建立的方程中，计算多糖含量。多糖损失率的公式如下：多糖损失率= （M1-M2）/M1×100%，式中，M1 为纯化前多糖的质量（mg）; M2 为纯化后多糖的质量（mg）。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

由图1可见，通过测定蒽酮硫酸法不同浓度葡萄糖溶液吸光度，得葡萄糖标准曲线 y=0.782x+0.002（R2=0.992）。

2.2 单因素试验

2.2.1 上样体积对甘孜川贝母多糖纯化损失率的影响。

从图2可以得出，在上样体积为1～3 BV时，随着上样体积的增加多糖损失率显著降低，并且在上样体积为3 BV时，甘孜川贝母多糖纯化的损失率达到最低，为23.73%±2.08%。但在上样体积3～5 BV时，随着上样体积的增加，多糖损失率呈上升趋势。故上样体积对甘孜川贝母多糖纯化损失率影响的最优值应在2～4 BV，因此以上样体积2～4 BV作为正交试验水平。

2.2.2 洗脱液体积对甘孜川贝母多糖纯化损失率的影响。

从图3可以得出，在洗脱液体积为1～2 BV时，由于洗脱液的体积较小，对于大孔吸附树脂中多糖的洗脱能力较差，故损失率会出现较为缓慢的上升;在洗脱液体积为2～4 BV时，随着洗脱液体积的增加，损失率呈下降趋势，并在洗脱液体积为4 BV时损失率最小，达33.48%±1.89%。随着洗脱液体积的增加，在4～5 BV时损失率出现上升趋势，此上升趋势较1～2 BV时较为明显。故洗脱液体积对甘孜川贝母多糖纯化损失率影响的最优值应在3～5 BV，因此选择洗脱液体积为3～5 BV作为正交试验水平。

2.2.3 流速对甘孜川贝母多糖纯化损失率的影响。

从图4可以得出，在流速为1～2 mL/min时随着流速的增加多糖损失率显著降低，并在流速为2 mL/min时甘孜川贝母多糖纯化的损失率最低，达29.07%±3.88%。在2～4 mL/min时，随着流速的增加，损失率呈上升趋势，但在4～5 mL/min 时多糖损失率呈下降趋势，与1～2 mL/min的趋势相比，此时的趋势较缓。故流速对甘孜川贝母多糖纯化损失率影响的最优值应在1～3 mL/min，因此选择流速为1～3 mL/min作为正交试验水平。

2.3 正交试验

从表2可以看出，影响甘孜川贝母多糖损失率因素从大到小依次为A（流速）、B（上样体积）、C（洗脱液体积），由此得到各因素的最佳搭配为A1B3C2，即流速为1 mL/min、上样体积为4 BV、洗脱液体积为4 BV。

2.4 验证试验

在正交试验得出的最佳条件组合基础上进行验证试验，即流速为1 mL/min、上液体积为4 BV、洗脱液体积为4 BV平行试验3次，得出甘孜川贝母多糖纯化损失率为13.63%±0.05%，比正交试验中最低损失率（17.65%±1.72%）还低。由此说明该正交分析试验条件对甘孜川贝母多糖纯化损失率优化是可行的。

3 讨论与结论

该试验以甘孜川贝母为材料，用水提醇沉的方法提取粗多糖并用AB-8型大孔吸附树脂纯化多糖，通过单因素试验和正交优化设计考察了大孔吸附树脂对纯化甘孜川贝母多糖时损失率的影响。考察洗脱流速单因素时，在4～5 mL/min时多糖损失率呈现下降趋势，但是与1～2 mL/min的趋势相比，此时的趋势较缓，可能是由于此时流速较快，虽然有利于增大吸附的速度，但同时也使大孔吸附树脂柱的吸附量有所降低[12]。正交试验结果表明，在流速1 mL/min、上液体积4 BV、洗脱液体积4 BV的条件下，损失率为13.63%，与张华等[5]研究的大孔吸附树脂静态吸附处理多糖时的损失率（44.41%）相比，仅是其0.30倍，结果较为理想。该研究可以降低大孔吸附树脂纯化多糖损失率，对于后续贝母多糖的开发利用具有重要的理论指导意义。

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