油污胁迫下土壤微生物群落结构对外源施用玉米秸秆生物质炭的响应

王金成， 井明博， 张绍鹏， 周天林， 刘光琇， 陈 拓， 吴胜伟

(1.陇东学院 生命科学与技术学院， 甘肃 庆阳 745000； 2.甘肃省高校陇东生物资源保护与利用省级重点实验室， 甘肃 庆阳 745000； 3.甘肃省极端环境微生物资源与工程重点实验室 中国科学院西北生态环境资源研究院， 甘肃 兰州 730000； 4.中国石油天然气股份有限公司长庆油田分公司第十一采油厂， 甘肃 庆阳 745000； 5.西安环发生物科技有限公司， 陕西 西安 710068)

当今环保领域石油污染土壤修复技术可采用物理法、化学法和生物法，其中生物法以其环境友好、成本低和大面积原位操作等特点因此受到环境科学工作者的广泛关注[1]。然而，油污土壤场地生态修复效果易受土壤生物学及非生物学环境因素的影响[2]，其中土壤酶活性和微生物学特性等生物学环境因子是决定油污土壤场地生态修复效果的关键因素[3]。目前，中国北方油污土壤生态修复对象主要包括落地原油和清罐原油，由于土壤油污含量高低不一且无法人为控制，因此土壤初始油污浓度高低则成为限制生物修复效果的主要环境因素之一。

近年来，生物炭作为一种新型功能性土壤调理剂，以其高比表面积、强电子交换性和强大的吸附作用等特点能有效改善土壤理化性质、酶活性和微生物生长环境，从而提升土壤污染物降解速率因此受到国内外污染土壤修复领域科研人员的广泛应用[4-5]。但目前有关生物修复时外源施用生物质炭的相关研究主要集中在重金属污染土壤方面[6-8]，但有关利用生物质炭实施石油污染土壤生物修复技术的研究报道相对较少，且研究内容主要集中在不同生物质炭原材料、不同的裂解温度和施用量对土壤石油污染物生物修复效果的影响等方面[6,9-10]。而有关轻重两种油污浓度胁迫时植物修复过程中外源施用生物质炭的相关报道则相对较少。

为此，本研究利用陇东黄土高原地区资源极为丰富的玉米秸秆制备生物质炭，以本研究团队之前报道的金盏菊(Calendulaofficinalis)为供试植物[2]，在长庆油田公司第二采油厂陇东污泥处理站进行了为期4个月的油污土壤场地修复试验。研究了在轻重两种油污浓度胁迫下外源施用玉米秸秆生物质炭土壤总石油烃(total petroleum hydrocarbons，TPH)去除率、酶活性及微生物群落结构的变化情况，目的在于：①分析探讨重度污染时植物修复过程中外源施用玉米秸秆生物质炭能否有效增加土壤TPH去除率；②明确轻重两种油污浓度胁迫时植物修复过程中土壤微生物群落结构和酶活性对外源施用玉米秸秆生物质炭的响应情况。本研究旨在为陇东黄土高原地区开展油污土壤场地生态修复工作提供新的技术方案和基础数据资料。

1 材料和方法

1.1 供试油污土样来源和试验设置

场地修复地点位于甘肃省庆阳市马岭镇长庆油田公司采油二厂陇东油泥处理站(东经107°22′19″，北纬30°36′15″)。本次试验设置了轻度(5%)和重度(20%)两种油污浓度污染土壤，轻度污染土壤为处理站在各井场所收集的落地原油污染土壤(TPH=5.08±0.39%)，而重度污染土壤则通过向TPH含量为40.75±2.86%清罐原油中添加落地原油污染土壤的方式配置而成。其中石油烃密度为0.926 g/cm3，烷烃含量58.67%，芳烃含量19.86%，胶质和沥青质含量11.94%，其他组分占9.53%。浇水平衡2周后测得TPH含量分别为4.87±1.15%和21.94±1.06%，文中以设置浓度为标识。

试验设置如表1所示，共计包括6个处理组，分别为轻度(TPH=5%)污染胁迫组(B5，J5，JB5)和重度(TPH=20%)污染胁迫组(B20，J20，JB20)以及2个对照组(CK5和CK20)。由西安环发生物科技有限公司负责修建束沿，深度为50 cm，大小为6 m×2 m，土层铺设厚度为25—30 cm。轻度污染土壤容重和pH值分别为1.34±0.28 g/cm3和8.78±0.11，重度污染土壤容重和pH值则分别为1.63±0.52 g/cm3和9.05±0.15。包括对照组(CK)在内，每个油污浓度设置设3个重复，共计24个束沿修复池。试验开始于2018年5月1日，结束于2018年9月1日，试验周期为4个月，生物质炭施用量为5%，其中植物修复组(J5，JB5，J20和JB20)播撒金盏菊种子500粒，覆土厚度约为1 cm，每3 d浇水一次，使土壤田间持水量保持在65%左右。

表1 不同处理组设置

1.2 测定指标及方法

1.2.1 生物质炭制备 玉米秸秆清洗后105 ℃烘干(24 h)，粉碎至1～2 cm长的小段后在马弗炉中350 ℃下缺氧裂解4.5 h，冷却后过60目筛备用[10]。灰分含量和pH值分别为35.74±1.71%和7.07±0.05，将制备好的玉米秸秆生物质炭通过搅拌机与油污土样进行充分搅拌以确保均一性。

1.2.2 土壤酶活性测定 土壤脱氢酶采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定，多酚氧化酶采用邻苯三酚比色法测定，多酚氧化酶活性以1 g土壤中紫色没食子素的毫克数表示[2-3]。

1.2.3 土壤微生物群落结构分析 委托北京百迈客生物科技有限公司。利用试剂盒(D5625-01，Soil DNA Kit，OMEGA，USA)提取土壤微生物总DNA。以341F/805R(341F引物: 5’-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG-3’；805R引物:5’-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’)对总DNA进行PCR扩增[7]。扩增步骤:94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，重复5个循环；94 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，重复20个循环；引入Illumina桥式PCR兼容引物，95 ℃预变性30 s，95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，重复5个循环。将PCR产物回收纯化后，利用Illumina HiSeq 2500平台进行土壤微生物高通量分析。

1.2.4 土壤TPH残留量测定及TPH去除率计算 土壤TPH含量采用超声—索氏萃取—重量法测定[10]。称取5 g风干土样于50 ml离心管中，加20 ml二氯甲烷后60W功率下超声萃取15 min，4 000 r/min离心10 min，收集上清液至已恒重的烧瓶中，重复萃取3次后将全部上清液54 ℃旋转蒸发至干，称重。前后重量差即为土壤TPH含量。TPH去除率计算公式如下：

1.3 数据处理与计算

利用SPSS 19.0和R2.15.2对数据进行分析，用Origin 8.0和R 2.15.2作图。对土壤TPH去除率、根际土壤酶活性、微生物群落多样性及其相对丰度等指标的测定值进行单因素方差分析，多重比较采用Duncan法，在95%水平分析差异显著性。为了解析轻重两种油污浓度胁迫时上述指标对金盏菊修复时外源施用玉米秸秆生物质炭的响应情况。基于Bray-Curtis相异指数，使用“envfit”函数，经Mantel检验与不同处理组土壤微生物群落结构显著相关的上述土壤环境指标拟合不同处理组菌群结构的非度量多维尺度(NMDS)排序图。为防止样点在各象限的分布发生移位，在拟合时对NMDS的排序轴进行旋转，以确保NMDS第一轴能够最大程度表征群落相异性的变异。不同处理组矩阵及矢量数据集分别用Bray-Curtis与Euclidean距离表示[3]。

2 结果与分析

2.1 轻重两种油污浓度胁迫下金盏菊根际土壤TPH去除率对施用玉米秸秆生物质炭的响应

图1为轻重两种油污浓度胁迫下不同处理组土壤TPH去除率变化情况。F检验结果显示，轻重两种油污浓度胁迫下不同处理组土壤TPH去除率差异极显著(p<0.01)。多重比较(Duncan，α=0.05)结果显示进一步显示，轻度污染时(TPH=5%)土壤TPH去除率依次为JB5(61.95±1.39%)>J5(49.59±2.14%)>B5(41.94±1.83%)>CK5(12.52±1.16%)(p<0.05)，其中JB5，J5和B5处理组与CK5相比土壤TPH去除率分别增加了4.95，3.96，3.35倍，表明轻度污染时3种处理方式均可有效增加土壤TPH去除率。重度污染胁迫时(TPH=20%)，土壤TPH去除率依次为JB20(56.44±1.89%)>B20(29.13±2.77%)>J20(20.90±2.36%)>CK20(5.91±1.05%)(p<0.05)，与CK20相比，JB20，B20和J20处理方式土壤TPH去除率分别增加了9.54，4.93，3.54倍，说明在重度油污时3种处理方式亦能显著增加土壤TPH去除率，其中金盏菊+玉米秸秆生物质炭处理方式(JB5和JB20)在轻重两种油污浓度胁迫时土壤TPH去除率均显著高于其他处理组(p<0.05)。

注：不同黑色和白色小写字母分别表示轻度和重度油污浓度胁迫下土壤TPH去除率在不同处理组间差异显著(Duncan，α=0.05)；不同大写字母表示轻重两种油污浓度胁迫下土壤TPH去除率在不同处理组间差异显著(Duncan，α=0.05)；横坐标上不同处理的具体意思详见表1。下同。

其次，就相同处理方式在轻重两种油污浓度胁迫时土壤TPH去除率变化情况而言(见图1)，重度污染时玉米秸秆生物质炭处理组(B20)和金盏菊单独处理组(J20)土壤TPH去除率与其轻度污染时相比分别下降了30.54%和57.85%，原因可能是由于重度污染会增加土壤黏度、阻碍土壤呼吸，从而限制了生物质炭吸附作用和金盏菊的生长，进而引起了玉米秸秆生物质炭和单独金盏菊处理方式土壤TPH去除率的显著降低。此外，JB5和JB20处理组土壤TPH去除率在轻重两种油污浓度胁迫时无显著差异，说明油污浓度在一定范围内的变化对金盏菊+玉米秸秆生物质炭处理方式土壤TPH去除率的影响相对较小。

2.2 轻重两种油污浓度胁迫下金盏菊根际土壤酶活性对施用玉米秸秆生物质炭的响应

如图2所示，不同处理组土壤脱氢酶和多酚氧化酶存在极显著差异(p<0.01)。就轻重两种油污浓度胁迫时CK组土壤脱氢酶活性而言，CK20组该酶活性与CK5组相比显著降低了1.91倍，说明油污浓度增加对土壤脱氢酶活性存在显著抑制作用。而本研究所设置的3个处理组而言，B5，J5，JB5处理组土壤脱氢酶活性在轻度污染时与CK5相比依次增加了1.90，2.47，4.59倍(p<0.05)，重度污染组B20，J20，JB20与CK20相比依次增加了3.12，2.25，8.87倍(p<0.05)，表明3个处理组在轻重两种油污浓度胁迫下均能有效提高土壤脱氢酶活性。其中金盏菊+玉米秸秆生物质炭(JB)处理方式的土壤脱氢酶酶活性增加量在轻重两种油污浓度胁迫时均显著高于金盏菊单独处理组(J)和生物质炭单独处理组(B)(p<0.05)，说明金盏菊+玉米秸秆生物质炭处理方式在增加土壤脱氢酶活性方面明显优于金盏菊和玉米秸秆生物质炭两种单独处理方式。

土壤多酚氧化酶活性方面，与CK5相比，JB5处理组土壤多酚氧化酶活性增加了5.97倍，而B5和J5处理组分别增加了2.45倍和2.66倍，说明金盏菊+玉米秸秆生物质炭处理方式在轻度污染组对土壤多酚氧化酶活性的促进作用相对较大。而重度污染时该酶活性高低依次为：JB20>B20>J20>CK20(p<0.05)，表明重度污染对金盏菊单独处理组(J20)土壤多酚氧化酶活性有明显抑制作用，这可能与重度污染对金盏菊生长产生了抑制作用有关。此外，重度污染时B20处理组土壤多酚氧化酶活性与轻度污染时B5和J5处理组无显著差异则体现出生物质炭在改善土壤酶活性方面优势明显。综上所述，金盏菊+玉米秸秆生物质炭(JB)处理组土壤脱氢酶和多酚氧化酶活性在两种油污浓度胁迫下均远高于其他处理组(见图2)，因此陇东黄土高原地区实施油污土壤植物修复时可通过外源施用玉米秸秆生物质炭的来提高土壤脱氢酶和多酚氧化酶活性，进而加速土壤TPH的生物降解效率。

图2 轻重两种油污浓度胁迫下不同处理组土壤脱氢酶和多酚氧化酶活性变化情况

2.3 轻重两种油污浓度胁迫下金盏菊根际土壤微生物群落多样性对施用玉米秸秆生物质炭的响应

利用Illumina HiSeq 2500平台对本研究所设置的不同处理组土壤样品进行了细菌基因组DNA高通量分析测定，结果如表2所示。不同处理组土壤样品测得有效序列数介于41 941.97～56 192.65之间，其中JB20和JB5处理组最高，B20，J5和B5处理组次之，两个对照组(CK20和CK5)相对较低(p<0.05)，而不同处理组土壤样品的测序覆盖率均大于98%，说明本次HiSeq测序深度足够。可操作分类单元(OTU)数量方面，轻度污染时不同处理组土壤微生物OTU数量高低依次为JB5>J5>B5>CK5(p<0.05)，而重度污染时则依次为JB20>B20>J20>CK20(p<0.05)。两种油污浓度相较而言，重度污染组JB20，B20，J20，CK20与轻度污染组JB5，B5，J5，CK5相比土壤微生物OTU数量分别降低了3.06%，4.03%，32.67%和9.44%，表明重度污染对金盏菊处理组土壤微生物OTU数量的影响相对较高，而JB20和J5之间、B20和B5之间无显著差异则说明外源施用玉米秸秆生物质炭可能是上述处理组土壤微生物OTU数量依然保持相对较高的原因之一。

表2 轻重两种油污浓度胁迫下不同处理组土壤细菌基因组DNA测序数据统计及多样性变化情况

其次，供试油污土壤微生物群落多样性分析结果如表2所示。重度污染组JB20，B20，J20和CK20与轻度污染组JB5，B5，J5和CK5相比土壤微生物Shannon指数分别降低了5.78%，5.59%，28.85%，9.77%，说明与轻度污染相比重度污染对土壤微生物多样性均不同程度产生了抑制作用，其中金盏菊(J)处理组下降程度尤为明显(p<0.05)。微生物丰度方面，重度污染组JB20，B20，J20和CK20与轻度污染对应的不同处理组相比土壤微生物Chao1指数依次降低了21.51%，2.67%，42.82%，3.30%，说明重度污染后金盏菊处理组(J)和CK组的土壤微生物丰度明显受到抑制。此外，B5与B20之间以及JB5和JB20之间土壤微生物丰度则无显著变化，这可能与外源施用玉米秸秆生物质炭可有效吸附了土壤石油烃，进而减缓了石油污染物的毒害作用有关。

2.4 轻重两种油污浓度胁迫下土壤微生物群落结构对外源施用玉米秸秆生物质炭的响应

在门分类水平上，供试油污土样细菌归属于22个门，其中相对丰度>1%的优势菌群主要包括变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi)等14个门(见图3)，上述14种优势菌门在J5，JB20和JB5处理组的相对丰度均>1%，而J20处理组的芽单胞菌门、Saccharibacteria门和Armatimonadetes门相对丰度均<1%，说明重度污染对金盏菊单独处理组上述3种优势菌门存在明显抑制作用，而B5和B20处理组Saccharibacteria门、硝化螺旋菌门、蓝细菌门和Armatimonadetes门相对丰度均<1%，推测硝化螺旋菌门和蓝细菌门相对丰度的降低可能与未种植金盏菊有关。上述结果说明不同处理方式下油污土壤微生物群落组成在门分类水平上存在明显差异，而金盏菊根际分泌物和玉米秸秆生物质炭有效改善土壤养分可能是金盏菊+生物质炭处理组方式土壤优势菌门数量最多的主要原因。

注：相对丰度数值由相应优势菌门3个重复的相对丰度平均值计算得出。

此外，F检验结果显示，上述14个优势菌门相对丰度在不同处理间均存在极显著差异(F变形菌门=35.184，F拟杆菌门=621.831，F酸杆菌门=453.569，F放线菌门=856.196，F绿弯菌门=922.821，F迷踪菌门=17 040.240，F芽单胞菌门=6 083.961，F疣微菌门=6 384.355，F浮霉菌门=9 767.236，FSaccharibacteria门=4 251.712，F硝化螺旋菌门=31 698.331，F厚壁菌门=7 593.169，F蓝细菌门=16 264.231，FArmatimonadetes门=187 653.106，p<0.01)。当油污浓度由轻度(5%)增至重度(20%)时，生物质炭处理方式(B)的变形菌门和厚壁菌门相对丰度分别降低了1.94%和4.51%(p<0.05)，但酸杆菌门和放线菌门相对丰度却显著增加了2.83%和2.56%(p<0.05)；金盏菊处理组(J)的变形菌门、迷踪菌门、芽单胞菌门、硝化螺旋菌门和Armatimonadetes门分别降低了3.48%，3.17%，3.61%，1.45%和1.16%(p<0.05)，而拟杆菌门和酸杆菌门相对丰度却显著增加了2.10%和4.33%(p<0.05)；金盏菊+生物质炭处理组(JB)中仅变形菌门相对丰度下降了2.70%(p<0.05)，而拟杆菌门则显著增加了1.08%(p<0.05)。上述结果中，除J20处理组与J5相比有5个优势菌门相对丰度显著降低外，生物质炭处理组的变形菌门和厚壁菌门以及金盏菊+生物质炭处理组的变形菌门相对丰度显著降低，而酸杆菌门、放线菌门和拟杆菌门的相对丰度也随之增加，且上述优势菌门中存在大量的原油降解功能菌[11]，结合土壤TPH去除率变化情况来看(见图1)，油污浓度的增加土壤微生物在门分类水平的相对丰度并不能简单的理解为抑制作用，即随着油污浓度增加土壤微生物群落结构会做出响应，各处理方式通过群落结构组成和数量变化来适应和消除土壤TPH的生态毒性，由此推测外源施用玉米秸秆生物质炭削弱了重度污染土壤石油污染物的生态毒性，进而驱动了土壤微生物群落结构发生改变，促进土壤石油污染物的生物降解。

在属分类水平上，对所有供试土壤样品相对丰度>1%的优势菌属分析结果如图4所示，其中主要包括鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)，Saccharibacteria属，赤杆菌属(Erythrobacter)，厌氧绳菌属(Anaerolineaceae)，黄色单胞菌属(Xanthomonadales)和志津氏菌属(Simiduia)等28种优势菌群。

为了明确轻重两种油污浓度胁迫下不同处理组土壤微生物群落结构在属分类水平的响应情况，采用Euclidean距离法对供试油污土壤微生物优势菌属分进行系统聚类，结果如图4所示。若在25.00至11.93相似水平截取，供试土壤可划分为2个类群，其中类群Ⅰ为JB5和JB20处理组，而其他处理组则划分为类群Ⅱ，说明在属分类水平上金盏菊+生物质炭处理组(JB5，JB20)群落结构相似性相对较高；若相似水平在8.67至11.93截取，类群Ⅱ则进一步划分为类群Ⅲ(J20，CK5，CK20)和类群Ⅳ(J5，B5，B20)，表明轻度污染对金盏菊处理组的影响相对较小，其土壤微生物群落结构在此相似水平与两个生物质炭处理组相似性相对较高，而重度污染对其影响相对较大因此其土壤微生物群落结构与两个CK组较为相似。当相似水平进一步在2.15至8.67截取，类群Ⅲ(J20，CK5和CK20)的进一步划分结果则反映出J20处理组和两个CK组之间土壤微生物结构亦存在显著差异，表明虽然重度污染对金盏菊生物存在可能存在抑制作用，但与未做任何处理的CK组相比土壤微生物群落结构在属分类水平的响应方式依然不尽相同。

注：热图中颜色深浅代表土壤微生物优势菌属的相对丰度大小，其数值大小由相应优势菌属3个重复的相对丰度平均值计算得出。

当油污浓度由轻度(5%)增至重度(20%)时，生物质炭处理组(B)的鞘氨醇单胞菌属、食烷菌属和迪茨氏菌属相对丰度显著降低了1.91%，1.86%和1.04%(p<0.05)，赤杆菌属和诺卡氏菌属相对丰度显著增加了1.11%和1.01%(p<0.05)；金盏菊+生物质炭处理组(JB)的赤杆菌属、食烷菌属、短杆菌属和Sulfuritalea属相对丰度显著降低了1.06%，1.12%，1.06%和1.28%(p<0.05)，志津氏菌属、Salinimicrobium属、迪茨氏菌属、不动杆菌属、Bryobacter属、无色杆菌属、溶杆菌属和Alkanindiges属相对丰度显著增加了1.12%，1.43%，1.04%，1.56%，1.20%，1.31%，1.18%和1.02%(p<0.05)，不难发现生物质炭处理组(B)和金盏菊+生物质炭处理组(JB)优势菌属变化趋势与门分类水平较为相似，即优势菌属的相对丰度做出响应，微生物群落结构发生改变，从而削弱土壤石油污染物的生态毒性。但与生物质炭处理组(B)和金盏菊+生物质炭处理组(JB)优势菌属变化趋势不同的是金盏菊单独处理组(J)中鞘氨醇单胞菌属、黄色单胞菌属、志津氏菌属、Salinimicrobium属、亚硝化单胞菌属、假单胞菌属、诺卡氏菌属、盐拟杆菌属、短杆菌属、Alkanindiges属、Sulfuritalea属和假黄色单胞菌属受重污染影响其相对丰度分别显著降低了3.42%，3.34%，2.06%，1.32%，1.09%，1.55%，1.11%，1.57%，2.39%，2.91%，1.85%和2.66%(p<0.05)，仅有Saccharibacteria属和不动杆菌属相对丰度显著降低了3.55和3.64%。综上所述，轻重两种油污浓度胁迫时B5和B20土壤微生物群落结构相似性相对较高原因在于28个优势菌属中仅有5个属相对丰度发生了显著变化(p<0.05)，而重度污染胁迫后JB20处理组中有4属相对丰度降低8属相对丰度增加(p<0.05)，这可能是生物质炭参与的不同处理方式土壤微生物群落结构相似性相对较高的原因之一，而重度污染后金盏菊处理组土壤微生物中仅有2个属相对丰度显著增加，却有12个属相对丰度显著降低(p<0.05)，原因可能是由于重度污染通过抑制金盏菊生长的方式影响了土壤微生物群落结构和组成。此外查阅文献报道可见，J20处理组中12个相对丰度显著降低的优势菌属存在大量的原油降解菌[11-12]，这可能是决定重度污染时金盏菊单独处理组土壤TPH去除率相对较低的关键因素之一。

2.5 不同处理组在轻重油污浓度胁迫时土壤环境因子与土壤微生物群落结构的非度量多维尺度(NMDS)分析

为了解析轻重油污浓度胁迫时油污土壤生物学及非生物学环境因子对不同处理方式的响应情况。即本研究所测定7项石油污染土壤生物学环境指标在驱动不同处理组土壤微生物群落结构(属分类水平)分异过程中的相对重要性。将Mantel检验与不同处理组土壤微生物群落结构显著相关(p=0.05)的5项土壤环境指标拟合于不同处理组菌群结构的非度量多维尺度(NMDS)排序图上(见图5)，胁强系数(stress)为0.253 1。由图5可见，本研究所设置的两个对照组(CK5，CK20和J20)相对集中，主要分布在NMDS1和NMDS2的负半轴，而其余处理组则主要集中在NMDS1正半轴上，上述NMDS点集分布方式体现了轻重两种油污浓度胁迫下不同处理方式土壤微生物群落结构在属分类水平的差异。

注：仅有95%置信水平与不同处理组土壤微生物群落结构显著相关的环境变量(p<0.05)拟合在NMDS排序图上。

由拟合结果可见(图5)，土壤脱氢酶(R2=0.821 4，p=0.007)、Chao1指数(R2=0.723 3，p=0.018)、多酚氧化酶(R2=0.685 7，p=0.024)和Shannon指数(R2=0.591 3，p=0.041)是决定J5，B5，B20，JB5和JB20土壤微生物群落结构分异于其他处理组的主要环境因子，而土壤TPH残留量(R2=0.806 4，p=0.009)则是引起CK5，CK20和J20处理组土壤微生物群落结构不同于其他处理组的主要环境因子。对上述5项与不同处理组土壤微生物群落结构显著相关的环境变量进行Pearson相关性分析结果显示，土壤TPH残留量分别与土壤脱氢酶(r=-0.906)，多酚氧化酶(r=-0.867)，Chao1指数(r=-0.906)和Shannon指数(r=-0.918)呈极显著负相关关系(p<0.001)，表明CK5，CK20和J20处理组相对较高土壤油污含量是决定其土壤微生物群落结构不同于其他处理组。结合轻重两种油污浓度胁迫下不同处理组土壤微生物α多样性和酶活性变化情况来看，J5，B5，B20，JB5和JB20处理组以其相对较高的土壤脱氢酶、多酚氧化酶、Chao1指数和Shannon指数是驱动土壤微生物群落结构分异于其他处理组的主要环境因子。

3 讨 论

3.1 轻重两种油污浓度胁迫下土壤TPH去除率对外源施用玉米秸秆生物质炭的响应

油污土壤场地生态修复过程中土壤TPH去除率是直接评价修复效果的重要指标之一[1]。Saum等[13]利用牧豆树(Prosopisjuliflora)对轻度油污土壤(TPH=2%)实施为期5个月的植物修复试验时外源施用了玉米秸秆生物质炭，结果显示牧豆树单独修复组(48.15±6.11%)和牧豆树+5%玉米秸秆生物质炭处理组(51.82±6.52%)土壤TPH去除率并无显著差异；Han等[14]利用黑麦草(Loliumperenne)和小麦秸秆生物炭在天津大港油田7.17%油污土壤实施了为期3个月的植物修复试验，结果显示黑麦草+5%小麦秸秆生物炭处理组土壤TPH去除率为36.08%，而黑麦草处理组则高达55.13%。上述试验结果说明中低油污浓度时外源施用生物质炭处理方式与植物修复相比土壤TPH去除率并未表现出明显促进作用，甚至略低于植物修复方式，这与本研究5%油污浓度胁迫时J5(49.59±2.14%)处理组土壤TPH去除率显著高于B5(41.94±1.83%)的试验结果基本一致(见图1)。而Wang等[15]分析探讨芦苇秸秆生物质炭对9.62%油污土壤修复效果时指出土壤TPH去除率为46.92%，且辅以(NH4)2SO4和K2HPO4营养物质后土壤TPH去除率高达51.35%%；Zhen等[16]利用稻壳生物质炭联合大米草(Spartinaanglica)对大港油田重度油污土壤(TPH=30%)实施为期40 d的生态修复试验时指出，大米草单独处理组土壤TPH去除率仅为19.11±2.14%，而大米草+5%谷壳生物质炭修复方式土壤TPH去除率为39.71±3.85%，这与本研究重度污染时(TPH=20%)金盏菊+玉米秸秆生物质炭处理组土壤TPH去除率56.44±1.89%，而金盏菊处理组仅为20.90±2.36%试验结的变化趋势基本一致(见图1)。究其原因在于轻度污染对植物生长的抑制作用相对较小，因此植物可充分发挥其根际降解或吸收富集特性进而有效提升土壤TPH的降解和转化效率[17]，但重度污染时植物生长受到抑制后其根际效应则明显减弱，故而TPH去除率也随之降低[18]。前人研究指出油污土壤外源施用生物质炭可有效改善土壤理化性质、调控土壤营养元素、优化微生物生长环境，加速石油污染物的生物降解[16]。但就本研究试验结果来看，轻度污染时金盏菊处理组(J5)土壤TPH去除率明显高于玉米秸秆生物质炭处理组(B5)，说明轻度污染时植物修复效果明显优于生物质炭的处理效果，而重度污染时生物质炭调控油污土壤营养元素，改善土壤结构的特性则逐步显现，表现为重度污染时玉米秸秆生物质炭处理组(B20)土壤TPH去除率明显高于金盏菊处理组(J20)。此外，本研究所设置的金盏菊+玉米秸秆生物质炭处理组土壤TPH去除率在轻重两种油污浓度胁迫时无显著差异，原因可能是由于重度污染时外源施用生物质炭有效吸收了土壤石油污染物[19]，从而降低石油烃的生态毒性从而缓解重度污染对植物生长的抑制作用，进而有助于植物发挥其根际降解或吸收富集特性[16]，因此在重度污染时依然保持相对较高的土壤TPH去除率。

3.2 轻重两种油污浓度胁迫下土壤酶活性对外源施用玉米秸秆生物质炭的响应

土壤石油污染物的生物降解需要多种土壤酶的参与，而氧化还原酶是决定土壤TPH生物降解的关键功能酶系，其中土壤脱氢酶和多酚氧化酶则是直接参与土壤烷烃和芳烃生物降解的主要关键限速酶[3]。Cao等[4]单独利用小麦秸秆生物质炭实施1%多环芳烃污染土壤修复试验时指出，土壤多酚氧化酶和脱氢酶活性分别显著下降14.55%和5.15%；而Zhen等[16]研究结果显示，稻壳生物质炭+大米草联合处理组分别在10%，30%和50%油污浓度胁迫时与大米草单独修复组相比土壤脱氢酶活性分别显著增加了21.57%，25.35%和11.48%，但随着油污浓度增加该酶活性总体上则逐步受到抑制。上述试验结果与本研究结果基本一致，说明单纯利用金盏菊或施用生物质炭对土壤脱氢酶和多酚氧化酶活性的促进作用相对有限，而金盏菊+玉米秸秆生物质炭处理方式对其酶活性的刺激作用相对较大。究其原因在于生物质炭主要通过吸附作用来降低土壤有机污染物浓度，进而间接刺激植物和微生物的活性实施生物降解[20]，因此在某种程度以一种保护作用的方式促进了植物根系和微生物生长、增加土壤肥力、稳定土壤结构，进而形成植物根系-生物质炭-微生物协同修复体系[21]，从而大幅增加土壤脱氢酶和多酚氧化酶活性来加速土壤TPH的生物降解[22]。此外，本研究所设置的轻重两种油污浓度生物质炭处理组(B5和B20)土壤脱氢酶活性无显著差异，这与Zhen等[16]研究结论不尽相同，这可能是油污浓度高低有关，即在生物质炭处理方式在一定浓度范围内土壤脱氢酶活性受油污浓度的影响相对较少，而当油污浓度过高时该酶活性可能会受到抑制，而这一推测有待进一步验证。

3.3 轻重两种油污浓度胁迫下土壤微生物群落结构对外源施用玉米秸秆生物质炭的响应

石油污染物对土壤生态环境的影响首先表现为改变土壤微生物群落结构组成[23]，而处理方式不同和油污浓度差异可驱动土壤微生物群落结构发生改变[24]。Sutton等[25]研究指出油污土壤中优势菌门主要包括变形菌门、厚壁菌门、放线菌门、酸杆菌门和绿弯菌门，而本研究CK5和CK20土壤微生物群落结构也印证了上述试验结论(图3)。Li等[26]分别采用鸡粪生物质炭、小麦秸秆生物质炭和木材生物质炭实施油污土壤生态修复研究时指出，上述3种生物质炭可有效增加绿弯菌门、酸杆菌门、硝化螺旋菌门和厚壁菌门相对丰度，而变形菌门、热微菌门(Thermomicrobia)和放线菌门相对丰度则显著降低。而Zhen等[16]研究表明油污土壤单独施用稻壳生物质炭后鞘氨醇单胞菌属、芽单胞菌属、假单胞菌属、Ohtaekwangia属相对丰度显著增加，联合大米草后Aquihabitans属、Solimonas属、Arenimonas属、分枝杆菌属(Mycobacterium)、噬氢菌属(Hydrogenophaga)、小梨形菌属(Pirellula)、丰祐菌属(Opitutus)和硫杆状菌属(Thiobacillus)相对丰度亦得到了显著提升，说明土壤微生物群落结构对生物质炭和植物修复的响应方式不尽相同，究其原因在于植物根际分泌物的化感作用和生物质炭改善土壤理化特性的作用机理不尽相同[27]。本研究中供试油污土样细菌归属于22个门，而相对丰度>1%的优势菌群共有14个门，其中J5，JB20和JB5处理组上述14个门的相对丰度均>1%，而B5和B20处理组Saccharibacteria门、硝化螺旋菌门、蓝细菌门和Armatimonadetes门相对丰度均<1%，表明硝化螺旋菌门和蓝细菌门相对丰度的降低可能与未种植金盏菊有关，这与Zhen等[16]和Visioli等[27]研究结论基本一致。而J20处理组的芽单胞菌门、Saccharibacteria门和Armatimonadetes门相对丰度均<1%则说明重度污染可能对金盏菊生长产生抑制作用进而影响了土壤微生物群落结构和组成。

在属分类水平上，所有供试土壤样品相对丰度>1%的优势菌属共28个，且轻重两种油污浓度胁迫时不同处理方式包括CK组在内土壤微生物优势菌属相对丰度存在极显著差异，表明土壤微生物群落结构对油污浓度变化的响应方式存在明显差异。由图4可见，轻重两种油污浓度胁迫时生物质炭处理组(B5和B20)土壤微生物群落结构相对稳定，表现为28个优势菌属中仅有5个属相对丰度发生了显著变化，而重度污染胁迫后金盏菊处理组(J20)与轻度污染组相比(J5)，鞘氨醇单胞菌属、黄色单胞菌属、志津氏菌属Salinimicrobium属、亚硝化单胞菌属、假单胞菌属、诺卡氏菌属、盐拟杆菌属、短杆菌属、Alkanindiges属、Sulfuritalea属和假黄色单胞菌属均显著降低，说明重度污染对生物质炭处理方式土壤微生物群落结构的影响相对有限，但对植物根际效应的抑制作用尤为明显，这可能是NMDS排序结果中J20处理组土壤微生物群落结构显著分异于其他处理组的主要原因(见图5)。而金盏菊+生物质炭处理方式(JB)应对油污浓度由5%增至20%，22个优势菌属中，仅赤杆菌属、食烷菌属、短杆菌属和Sulfuritalea属4个优势菌属相对丰度显著降低，但志津氏菌属、Salinimicrobium属、迪茨氏菌属、不动杆菌属、Bryobacter属、无色杆菌属、溶杆菌属和Alkanindiges属8个属相对丰度显著增加，加之上述优势菌属中包括了大量原油降解功能菌属[11-12,28-29]，体现了植物+生物质炭处理方式通过改变土壤微生物群落结构和数量，通过增加原油降解功能微生物种类和数量的方式来加速重度污染是土壤TPH的生物降解效率。

此外，本研究发现轻重两种油污浓度胁迫下生物质炭处理组(B5和B20)土壤微生物群落结构组成差异相对较小，而金盏菊处理组(J5和J20)土壤微生物群落结构却发生较大变化，且多数功能性微生物相对丰度均显著降低。结合NMDS拟合结果(见图5)可见，土壤脱氢酶、Chao1指数、多酚氧化酶和Shannon指数是决定J5，B5，B20，JB5和JB20处理组土壤微生物群落结构分异于其他处理组的主要环境因子，表明与生物质炭优化土壤结构和理化特性来改善土壤微生物群落结构的作用方式相比，重度污染时植物根际化感作用对土壤微生物群落的影响极其有限。

4 结 论

(1) 轻重两种油污浓度胁迫时分别单独施用玉米秸秆生物质炭和种植金盏菊处理方式土壤TPH去除率、土壤脱氢酶和多酚氧化酶活性相对较低，而金盏菊+玉米秸秆生物质炭处理方式上述指标在轻重两种油污浓度胁迫时土壤TPH去除率分别高达61.95±1.39%和56.44±1.89%；与重度污染时金盏菊和玉米秸秆生物质炭单独处理组相较而言，金盏菊+玉米秸秆生物质炭处理方式可显著增加重度污染土壤TPH去除率。

(2) 重度污染对单纯植物修复方式的抑制作用进而导致土壤微生物优势菌门的结构组成和数量亦受到显著影响。本研究所设置的金盏菊+生物质炭处理组和生物质炭单独处理组在轻重两种油污浓度胁迫下土壤微生物群落结构组成差异相对较小，但上述两种处理方式间土壤微生物群落结构存在显著差异，而金盏菊单独处理组土壤微生物群落结构则发生较大变化，且多数功能性微生物相对丰度显著降低。

(3) 黄土高原陇东地区油污土壤实施场地生态修复时，轻度污染时金盏菊单独处理方式和金盏菊+玉米秸秆生物质炭联合处理方式均可有效增加土壤TPH去除率，但在重度污染时建议采用金盏菊+玉米秸秆生物质炭联合处理方式，即应对轻重两种油污浓度胁迫时玉米秸秆生物质炭均可作为土壤调理剂来提升修复效果。