儿童失神经支配马蹄内翻足腓肠肌病理组织学观察

夏 冰，刘福云， 张 宇， 陆亚东， 邢光卫， 郭永成， 牛学强， 董延召， 李新伟

郑州大学第三附属医院小儿骨科 郑州 450052

马蹄内翻足是小儿骨科常见的足踝畸形，分为特发性和继发性两种类型,其中约80%患儿病因不明确且不合并其他系统畸形，称为特发性马蹄内翻足。特发性和继发性马蹄内翻足由于病因不同，导致其病变肌肉的病理改变也可能不同。继发性马蹄内翻足多见于脊髓栓系综合征，由于中枢及外周神经损伤，导致踝关节周围肌肉神经支配异常，进而出现肌力不平衡，最终发展为马蹄内翻足。与特发性马蹄内翻足相比，继发于失神经支配的马蹄内翻足矫形更为困难,临床复发率和并发症发生率均较高[1]。本研究通过光镜、扫描电镜及透射电镜观察特发性和继发于脊髓栓系综合征的马蹄内翻足患儿腓肠肌组织结构的变化及差异，报道如下。

1 对象与方法

1.1研究对象选取2011年1月1日至2017年12月31日在我院诊治的继发于脊髓栓系综合征的马蹄内翻足患儿23例(共29足)作为试验组。其中男15例，女8例，年龄7个月～3岁4个月；单侧17例，双侧6例。对照组取同期接受跟腱延长手术治疗的特发性马蹄内翻足患儿12例(共17足)，其中男9例，女3例，年龄9个月～2岁9个月；单侧7例，双侧5例。试验组中脊髓病变位于胸段(T2～T10)1例，胸腰段(T11～L1)2例，腰段(L2～L3)5例，腰骶段(L4～S1)14例，骶尾部(S2以下)1例；合并脊柱侧弯5例，髋关节脱位2例；足部感觉丧失3例，感觉减退14例，感觉正常6例。对照组均无脊髓病变及感觉异常。本研究经患儿家属知情同意并得到医院伦理委员会审批。

1.2病理组织学观察术中取腓肠肌远端、腱腹交界近端2 cm肌腹深处活体组织，所有标本去除挤压、牵拉的组织后，均沿肌纤维方向取大小约1 mm×1 mm×2 mm的长条。

1.2.1 光镜观察 取出患儿部分腓肠肌, 甲醛固定、梯度乙醇脱水、二甲苯透明，石蜡包埋、6 μm厚切片；HE染色，乙醇脱水后用二甲苯透明切片，树胶封固并盖上盖玻片，使用OLYMPUS BX53光镜观察。

1.2.2 扫描电镜观察 取患儿腓肠肌，生理盐水清洗标本表面。戊二醛固定液固定，PBS浸洗2次，4 ℃四氧化锇固定液固定2 h，PBS浸洗2次，丙酮梯度脱水，乙醇醋酸双氧铀块染色2 h或过夜。醋酸戊酯置换10 min。临界点干燥后喷金，S-3500扫描电镜下观察并拍照。

1.2.3 透射电镜观察 取患儿腓肠肌，生理盐水清洗。戊二醛固定，PBS浸洗3次，四氧化锇固定液4 ℃固定2 h，PBS浸洗2次，丙酮梯度脱水，乙醇醋酸双氧铀块染色2 h或过夜。还氧丙烷置换10 min。37 ℃条件下用丙酮与环氧树脂按体积比3∶1、1∶11、1∶13依次混合浸透15 min，然后纯树脂浸透30 min；盛于有环氧树脂812、815包埋液的包埋板中。置入烤箱，37 ℃、45 ℃、60 ℃各24 h进行聚合反应；Leica超薄切片机厚约50 nm切片。醋酸双氧铀电子染色45 min，柠檬酸铅电子染色30 min，使用H-7500型透射电子显微镜观察并拍照。

1.3统计学处理采用SPSS 21.0分析。试验组和对照组肌纤维脂肪变性和肌丝强直性收缩发生率的比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1腓肠肌光镜观察结果试验组及对照组光镜下均可见腓肠肌肌纤维呈长柱形，细胞核呈椭圆形，位于肌膜的下方；肌浆内肌原纤维丰富，呈细丝状，可见I带和A带(图1)。试验组腓肠肌肌丝空泡化严重，纤维化和脂肪化明显，出现凋亡现象；细胞核呈条索状；出现大量的成纤维细胞。对照组仅部分腓肠肌呈现上述变化。

试验组75.9%(22/29)出现肌纤维脂肪变性，对照组为35.3%(6/17)，两者比较差异有统计学意义(χ2=7.405，P=0.007)。

A:对照组;B:试验组

2.2腓肠肌扫描电镜下表现对照组胶原纤维增粗，大部分标本肌束排列及走形良好，仅部分存在缺损及扭曲，少数标本出现肌肉萎缩(图2A)；试验组部分胶原纤维增粗明显，肌束水肿、间隙增大，肌节排列紊乱、增宽，部分有缺损(图2B)。

试验组44.8%(13/29)出现肌丝强直性收缩，对照组为11.8%(2/17)，两者比较差异有统计学意义(χ2=5.331，P=0.021)。

A:对照组;B:试验组

2.3腓肠肌透射电镜下表现对照组镜下可见线粒体肿大，部分空泡化，部分嵴与膜融合，嵴有溶解、断裂、缺失；肌浆网轻度扩张；肌丝排列轻中度紊乱，Z线增宽、H带缩短；糖原数量轻度减少；胶原纤维横纹规律性存在，纤维较粗，排列整齐(图3A)。试验组大量线粒体出现空泡化、萎缩和破裂，嵴与膜融合、模糊不清，多数嵴发生溶解、断裂、缺失；肌丝肿胀、Z线及H带紊乱不清、对位不良、残缺和溶解；肌纤维细胞变性坏死，细胞膜消失；肌原纤维间隙较大，数量减少，肌丝强直性收缩明显；肌纤维束间糖原数量明显减少(图3B)。

A:对照组;B:试验组

3 讨论

马蹄内翻足是小儿骨科常见畸形，根据其临床症状出现早晚及有无合并畸形，分为特发性及继发性两种类型。继发性马蹄内翻足可见于中枢神经系统疾病及外周神经损伤，特别是多见于脊髓栓系综合征，常常合并髋、膝、足踝部畸形,大小便功能障碍,下肢肌肉麻痹，肌力失衡及下肢感觉功能障碍[2]。据文献[3-4]报道，30%～50%的脊髓栓系综合征患者可能继发马蹄内翻足，且畸形程度往往较重，治疗后复发率及并发症发生率较特发性马蹄内翻足高[1],预后较差。国内外曾有学者[5-6]对特发性马蹄内翻足内侧及小腿前外侧深筋膜进行电镜观察及分析，可见成纤维细胞相对增多、细胞体积增大、胞质丰富、内质网扩张、线粒体肿大等，但均未对患足周围肌肉组织进行超微结构的观察。

本研究结果显示，光镜下试验组75.9%出现肌纤维脂肪变性，对照组为35.3%，提示与特发性马蹄内翻足相比，继发性马蹄内翻足腓肠肌在失神经支配下，肌纤维更容易出现脂肪变性；扫描电镜下，试验组44.8%出现肌丝强直性收缩，而对照组仅为11.8%，且为轻微强直性收缩，提示失神经支配下，腓肠肌收缩功能更差，更容易出现强直性收缩。国外学者[7]在大鼠实验中发现：大鼠脊髓损伤时，骨骼肌会迅速失去质量和收缩力，继而导致肌原纤维和收缩蛋白的快速分解以及糖原储备减少，造成骨骼肌进行性萎缩及功能减退，甚至出现强直性收缩[8]，肌肉组织最终出现纤维化和脂肪变性。这与我们在试验组观察到的肌纤维脂肪变性增加、肌丝强直性收缩增多等结果一致。

本研究透射电镜下还发现大量线粒体空泡化、萎缩、破裂，嵴溶解、断裂、缺失，肌纤维束间糖原数量明显减少，提示继发性马蹄内翻足腓肠肌在失神经支配后其病理改变更重。这可能是其治疗困难、复发率相对较高且预后更差的重要原因。

有学者[9]在小鼠实验中发现，骨骼肌失神经支配后，线粒体呼吸功能和细胞色素c氧化酶活性降低，小鼠腓肠肌线粒体DNA拷贝数量减少；此外受损的线粒体将产生高水平的活性氧，并释放促凋亡因子，如细胞色素c、凋亡诱导因子等，最终诱导细胞死亡[10]。这些病理改变不仅使肌细胞供能减少，还可导致肌细胞萎缩、生长减慢及停滞，进一步降低腓肠肌收缩功能[11]。

综上所述，与特发性马蹄内翻足腓肠肌相比，继发于脊髓栓系综合征的马蹄内翻足腓肠肌脂肪变性、肌丝强直收缩、腓肠肌内线粒体空泡化等超微结构改变更为明显，提示失神经支配状态下导致的继发畸形病变更为严重，治疗上也更加困难。但对于跟腱延长治疗后的腓肠肌超微结构如何变化还有待进一步研究。