氮素对枸杞甜菜碱及其代谢关键酶的影响

周佳瑞，刘根红，郑国琦

(宁夏大学，宁夏 银川 750021)

【研究意义】枸杞(LyciumbarbarumL.)为茄科枸杞属，多年生落叶灌木。作为栽培作物人工种植己有上千年历史，主要分布在我国宁夏、新疆、青海等地[1]。宁夏作为枸杞的原产地，有500多年的栽培史。枸杞栽培主要与其有效成分有关，研究发现枸杞中甜菜碱有增强人体免疫力、抑制肿瘤生长等药理作用[2]。甜菜碱是枸杞子中主要有效成分之一，属季铵盐类化合物[3]，于植物中广泛存在。甜菜碱在枸杞植株细胞内以胆碱为底物，经胆碱单加氧酶(CMO)与甜菜碱醛脱氢酶(BADH)逐步催化氧化生成，即：胆碱→甜菜碱醛→甜菜碱[4]，CMO是植物中特有的一种特殊加氧酶(oxygenase)，由于其活性测定较为困难，因此近年来才逐渐对其有较深入的了解[5]。这两种酶均由单一核基因编码并存于叶绿体基质内[6]，其活性在逆境胁迫时增强,光诱导下促进甜菜碱合成。【前人研究进展】宁夏作为枸杞道地栽培地，其产量与品质都是决定其商品性的重要因素。产量在多年栽培研究中，基本趋于稳定，近年来更多关注在其品质栽培。枸杞的品质与环境因子、栽培条件等密切相关。武蕾[7]研究认为高肥力显著促进叶片生长，提高枸杞产量并显著改善枸杞果实品质，果实中甜菜碱等成分含量均有不同程度的提高；张建青[8]等进行不同施肥水平对枸杞产量的影响，结果表明，优化纯氮量，明显提高枸杞鲜果产量；韩宏伟[9]等在北疆区研究不同施肥水平对成龄枸杞生长及产量的影响，结果表明适时追施 N、P、K 肥，能有效提高枸杞春秋梢生长量及产量等指标；明鹤等[10]研究认为枸杞采收时期不同，甜菜碱含量亦随之发生变化。植物主要通过根系从土壤中吸收养分，肥料的施深不同，其效果发挥即不同，同时根系对养分的吸收和干物质积累等也会发生变化[11]。罗健航[12]等研究表明，水平施肥方法对枸杞干果产量无显著的影响，但随着施肥深度增加，枸杞干果产量亦随之增加。综上所述，大多研究多集中于栽培因子与甜菜碱及枸杞生长发育之间的关系，但对氮素不同施肥处理条件下枸杞甜菜碱及代谢关键酶的影响缺乏深入的研究。宁夏枸杞栽培影响其产量与品质的主要因子是灌水量与氮肥用量，灌水在宁夏基本是模式化灌溉，一年三水(第三次为冬灌水)，灌水量控制在200 m3/667m2。因此氮肥的施用就成为灌区枸杞产量与品质的主要限制栽培因素。氮素是枸杞需求量最大的养分元素，其施用量与施用方式很大程度影响枸杞次生物质含量变化，甜菜碱是枸杞主要次生物质之一，其含量变化与氮素有很大关系，但其施用量与施用方式如何影响其变化研究国内外研究还不深入。因此，开展不同施氮量及施氮方式对枸杞甜菜碱含量及代谢关键酶的影响，通过对枸杞生长期间对其果实及茎叶生长状况、产量、甜菜碱含量及其代谢关键酶的指标测定，明确氮素对枸杞产量及品质的影响规律，对枸杞品质化栽培具有重要的理论支持。【本研究切入点】该研究至2017年开始，相继做了2年，2017年主要开展氮素不同施量、不同施氮深度、不同氮基追比例单因子试验，研究单因子水平条件下各因子水平对甜菜碱含量及关键代谢酶含量的影响，为明确三因子对枸杞甜菜碱及代谢关键酶之间的关系，2018年开展了氮素不同施氮水平、不同施氮深度、不同氮素基追比例的三因子复合试验，明确氮素与枸杞甜菜碱含量及代谢关键酶间关系。【拟解决的关键问题】为进一步从蛋白水平分析氮素对枸杞甜菜碱及关键酶代谢关系奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验设在宁夏农垦南梁农场，该地区位于东经106°13′，北纬38°40′，海拔1090 m。属典型的大陆性气候，干旱少雨，年降雨量约250 mm，热量充足，温差大，无霜期短。土壤以盐分较高的灌淤土为主，该地区种植枸杞总面积1000万平方米。

1.2 试验材料

供试材料选择宁夏主栽品种：“宁杞1号”，该枸杞品种抗逆性较强。

1.3 试验设计

试验于2018年3-10月进行，设置三因素三水平，分别为氮肥施用深度A(0～20、20～40、40～60 cm)，基追比例B(3∶1、2∶1∶1、3∶2∶1)氮素施用量C(0、30、40、50 kg/666.7m2)27个处理，3次重复，共81个小区。各处理设18棵树，株距 1 m，行距3 m，各小区面积56 m2。施肥时期以4月中旬开沟基施并灌水，5月底、6月初结合锄草追肥 1 次，8月初结合中耕追肥 1 次，供试肥料为尿素(氮素含量46 %)，有机肥配施磷钾肥作底肥，常规磷肥施量(纯磷40 kg/666.7m2)，常规施钾量(纯钾30 kg/666.7m2)，常规有机肥(氮素含量0.53%)施用量(基施腐熟有机肥3000 kg/666.7m2)、常规灌水量(200 m3/666.7m2)，其他田间管理同大田生产。

表1 供试土壤的基本理化性质

1.4 指标测定

甜菜碱含量：采用高效液相色谱法测定。甜菜碱醛脱氢酶、胆碱单加氧酶：比色法。参考梁峥[13]的方法提取BADH,按骆爱玲等[14]方法，采用BIO-RED MINI电泳系统测定BADH含量。产量测定：选取各小区中间区域的枸杞样株20株，在果实成熟期，对观测样株单独采摘测定质量。

1.5 数据分析

利用 Microsoft Excel 2010和SPSS19.0软件对试验数据进行整理与分析。

2 结果与分析

2.1 不同施氮处理对枸杞甜菜碱的影响

2.1.1 不同施氮深度对枸杞甜菜碱含量的影响 不同施氮深度对枸杞甜菜碱含量影响的差异较大，枸杞甜菜碱含量在3种不同施氮深度处理下均存在显著性差异。由图1可以看出，整个生长期内枸杞甜菜碱含量整体呈现先增加后降低的趋势，在6月20日，枸杞甜菜碱含量达到最高值，此后下降，这可能与后期土壤氮素供应逐渐减少有关。在不同时期内，甜菜碱含量均在施氮深度为0～20 cm时最高，20～40 cm次之，在40～60 cm时含量最低，在6月20日甜菜碱含量达到最高时，A1处理下的甜菜碱含量比A2、A3两处理分别高10 %、17.28 %。认为在施氮深度为0～20 cm时，有利于甜菜碱含量积累，且随着施氮深度的增加，甜菜碱含量降低。这可能与枸杞地表层盐分含量及当地长期施肥方式有关，该地区属于典型盐渍化土壤，盐分运移对氮素的吸收有明显影响；长期的传统浅层施肥，使枸杞根系主要分布在0～30 cm，30 cm以下根系分布较少，因此氮肥施深后其当年吸收效果也不佳。

图1 不同施氮深度枸杞甜菜碱含量

2.1.2 不同基追比例对枸杞甜菜碱含量的影响 由表2可以看出，不同基追比例对枸杞甜菜碱含量影响差异性不同。整个生长期内B1(3∶1)处理下枸杞甜菜碱含量与B2(2∶1∶1)处理间差异均不显著，与B3(3∶2∶1)处理间果实生长前期有显著性差异，生长后期则表现差异性不显著。在7月20日至8月5日，枸杞甜菜碱含量在三处理间差异均不显著。枸杞甜菜碱含量在果实生长前期表现为B1>B2>B3，在7月5日之后，则表现为B2>B1>B3。氮素是枸杞甜菜碱合成必需的大量元素之一，其施肥量与施肥方式直接影响其甜菜碱的合成，试验表明氮肥前期适量多施，后期适量追施，对枸杞甜菜碱合成有利。

2.1.3 不同施氮水平对枸杞甜菜碱含量的影响 由图3可以看出，不同施氮水平对枸杞甜菜碱含量影响不同。枸杞甜菜碱含量在生长期内均呈现先增长后下降的趋势，且整体表现为C1>C2>C3>C4，甜菜碱含量在6月20日为最高值，C1处理分别较C2、C3、C4处理高2.67 %、7.69 %、10 %。在果实生长前期，枸杞甜菜碱含量在不施氮(C1)时与C3、C4两处理有显著性差异，与C2处理则无显著性差异；而在果实生长后期，则与不同施氮水平间均表现差异性显著,C3、C4两处理在生长期内甜菜碱含量变化不显著。分析发现在不施氮的情况下，甜菜碱的含量最高，而随着施氮量的增加，甜菜碱含量反而减少。甜菜碱是一种渗透调节物质，很多研究认为枸杞在逆境胁迫下利于甜菜碱的累积，因此，低氮水平影响其氮素积累水平的主要是逆境条件与施氮量，在高氮水平下，影响甜菜碱积累的可能是其它逆境因子，这可能是导致在氮素施量相对较高水平下不利于甜菜碱累积的主要原因。

图2 不同基追比例处理下枸杞甜菜碱含量

图3 不同施氮水平枸杞甜菜碱含量

2.2 不同施氮处理对枸杞代谢相关酶含量的影响

2.2.1 不同施氮深度对枸杞甜菜碱醛脱氢酶及胆碱单加氧酶含量的影响 由表2可以看出，甜菜碱醛脱氢酶含量呈现先增加后降低的趋势，在6月20日时含量最高，且在此时期内，A2(20～40 cm)处理下含量最高，比A1、A3处理分别高出28 %、62 %；胆碱单加氧酶含量前期增长至6月5日后呈现先降低后增长的趋势，在7月20日后又开始降低。整个生长期内，不同施氮深度对枸杞甜菜碱醛脱氢酶及胆碱单加氧酶含量影响不同，除6月20日外，三处理间2种酶含量均差异性显著且表现为A1>A2>A3。说明在施肥深度为0～20 cm时，对2种代谢酶含量影响最大。这可能与根系分布位置及表层盐分含量有关。

表2 不同施氮深度处理枸杞甜菜碱醛脱氢酶及胆碱单加氧酶含量

2.2.2 不同基追比例对枸杞甜菜碱醛脱氢酶及胆碱单加氧酶含量的影响 由表3可以看出，甜菜碱醛脱氢酶及胆碱单加氧酶含量在不同基追比例下含量变化不同。整个生长时期内，甜菜碱醛脱氢酶含量表现为B1处理与B2、B3两处理间有显著性差异，B2与B3处理间无差异；胆碱单加氧酶含量则表现为B1处理与B3处理间差异显著。除7月5日外，甜菜碱醛脱氢酶含量均在B1(3∶1)处理时最高，B2、B3间无差异，在6月20日，其含量达到峰值，B1处理较B2、B3处理分别高出43.16 %、44.68 %；胆碱单加氧酶含量除6月5日外，整体表现为B1(3∶1)处理下含量最高，B2(2∶1∶1)次之。说明氮肥前期多施，适量追施，利于两种酶含量的积累。

表3 不同基追比例枸杞甜菜碱醛脱氢酶及胆碱单加氧酶含量

2.2.3 不同施氮水平对枸杞甜菜碱醛脱氢酶及胆碱单加氧酶含量的影响 由表4可以看出，枸杞甜菜碱醛脱氢酶及胆碱单加氧酶含量在不同施氮水平下差异性不同。甜菜碱及甜菜碱醛脱氢酶与胆碱单加氧酶含量在生长期内均呈现先增长后下降的趋势，6月20日甜菜碱醛脱氢酶达到最高，C1(不施氮)处理为3.11 ng/100μg，较C2、C3、C4处理分别高出58 %、68 %、78 %。2种酶含量在整个生长期内整体表现为C1>C2>C3>C4，说明在不施氮的情况下，2种代谢酶的含量最高，随着施氮量的增加，2种代谢酶含量反而减少。甜菜碱醛脱氢酶及胆碱单加氧酶在枸杞体内催化甜菜碱合成，其含量变化趋势与甜菜碱含量变化趋势相吻合，充分证实枸杞生长期间两种酶对甜菜碱的生理调控作用。

表4 不同施氮水平枸杞甜菜碱醛脱氢酶及胆碱单加氧酶含量

2.3 不同施氮处理对枸杞产量的影响

由表5可以看出，不同施氮深度处理下，枸杞产量表现为A1>A2>A3，A3处理下枸杞产量显著低于其它两处理，分别比A1、A2低22.68 %、21.09 %，说明施肥深度在0～20 cm时于枸杞增产有利，这与枸杞根系分布位置及当地施肥方式有关；枸杞产量在不同基追比例下表现为B1与B2处理间无差异，而B3处理与另外两处理间差异性显著,在基追比为3∶1时枸杞产量最高；在不同施氮水平下，3种施氮水平下枸杞产量均大于不施氮(C1)处理，这说明合理的氮肥用量对于提高枸杞产量具有重要作用。其中又以C3处理下枸杞产量最高，C4处理下产量最低，认为施氮肥40 kg/667m2时，利于枸杞增产，而在施氮过量时则可能对果实的生长有抑制作用。

表5 不同施氮处理下枸杞产量

3 讨 论

肥料的施用位置不同，肥料效果的发挥即不同，根系对养分的吸收和积累也会发生变化，从而影响作物产量及品质。试验中氮肥施用深度为0～20 cm时，枸杞甜菜碱、甜菜碱醛脱氢酶、胆碱单加氧酶含量及产量最高。占玉芳等[16]在河西灌区研究枸杞根系分布，发现根系中的细根和粗根集中分布在20～40 cm土层，其生物量的水平分布亦随着距离的增加呈指数性下降。而本试验则发现，氮肥施用深度为0～20 cm时养分对植株贡献最大，这可能与农民施肥方式有关，当地施肥方式为沟施，沟深约20 cm，养分常年分布于20 cm左右，影响该区域根系活力，提高植株吸收养分的速率，从而提高肥料利用率，提高枸杞果实品质，使果实中甜菜碱含量提高[17]。胥生荣[18]等也提出宁夏枸杞行间操作主要以浅耕为主,对30 cm以下土壤扰动较小,因而影响下层根系对养分的吸收。且随着氮肥深度的增加，深层氮比浅层更易流失，不能被植物充分吸收[19]。同时由于试验地位盐碱地，盐分多积聚于表层，在盐胁迫的条件下，甜菜碱的含量与甜菜碱醛脱氢酶(BADH)活性均会增加[20]。

枸杞作为一种较喜肥作物，其在不同时期需肥量不同，合理的氮肥基追比例，可以提高其产量及品质。试验发现，7月5日前，在基追比为3∶1时，枸杞甜菜碱含量最高，而在7月5日之后，则在基追比例为2∶1∶1时最高。说明不同时期施氮较高时甜菜碱含量也较高，这与孟凤[21]等人研究一致。枸杞产量、甜菜碱醛脱氢酶与胆碱单加氧酶含量整体在基追比例为3∶1时含量最高，说明基肥多施有利于两种酶的积累且利于枸杞增产。

试验发现施氮肥可以显著提高枸杞产量，这与刘敏[22]、李永梅[23]等研究结果类似。枸杞作为较喜肥作物，在一定范围内增加施肥量即可增加其产量。本试验中以C3处理下枸杞产量最高，认为施氮肥 40 kg/667m2时，利于枸杞增产。但枸杞甜菜碱含量及 2 种代谢酶含量则表现为不施氮处理高于施氮处理，武蕾等[24]通过盆栽试验，认为不同土壤肥力配方施肥可以提高枸杞果实品质，使果实中甜菜碱含量提高；刘建文等[25]研究也认为土壤肥力高于甜菜碱积累有利。而本试验结果与之不同，随着施氮量增加，甜菜碱含量降低。可能是因为试验地为盐碱地，在盐胁迫条件下，枸杞细胞内会累积大量甜菜碱，以维持细胞的正常膨压，并参与稳定复杂蛋白质的高级结构，且适量施氮肥，对盐胁迫也有一定的缓解作用[26]，因而甜菜碱含量随施氮量增加逐步降低。

4 结 论

研究表明，枸杞甜菜碱、甜菜碱醛脱氢酶及胆碱单加氧酶含量与产量在施肥深度为0～20 cm 时最高，随着施肥深度的增加而逐渐降低。随着施氮量的增加，枸杞甜菜碱及 2 种酶的含量降低，而枸杞产量大幅增加，在40 kg/667m2达到最大值。枸杞产量、甜菜碱醛脱氢酶与胆碱单加氧酶含量整体在基追比例为3∶1时最高。因此，在本试验条件下，施肥深度为0～20 cm，基追比例为3∶1利于甜菜碱及 2 种酶含量累积。得出以上结果，以期为枸杞品质化栽培提供理论参考。