坚果表型性状在核桃种质鉴定中的应用

李亚兰，潘存德，陈 虹

(新疆农业大学 林学与园艺学院/新疆教育厅干旱区林业生态与产业技术重点试验室，新疆 乌鲁木齐 830052)

【研究意义】核桃(JuglansregiaL.)系胡桃科(Juglandaceae)胡桃属(Juglans)多年生落叶乔木，又名胡桃，是世界重要的古老坚果树种之一[1-2]。其坚果富含油脂、矿物质元素和维生素等，是一种具有极高营养、保健和药用价值的食品[3-4]。新疆作为我国核桃的重要产区之一，不仅有野生核桃的种质资源分布，而且有千年以上悠久的栽培历史[5-6]，在自然和人为的双重作用下孕育了丰富的核桃种质资源。植物丰富的种质资源是种质挖掘利用、保护及其相关研究的物质基础，而对其表型性状的鉴定评价则是挖掘利用的前提和依据。同时表型性状评价还是种质资源遗传多样性评价不可或缺一分，具有简便直观的优点，被广泛应用于不同植物种质的分类鉴定和核心种质的构建[7-8]。其中，植物果实性状是比较稳定的遗传特征，在分类与鉴定中具有重要价值[9]。【前人研究进展】R语言因其开源性、可移植性、灵活性等优点，被越来越多的科研人员所喜爱和使用，目前主要用于生态学[10]、基因差异表达[11]、田间试验数据的分析[12]等方面的工作，但鲜有研究者将其应用于种质分类、形态及遗传变异的相关研究。为了提供核桃育种工作表型性状选择的标准[13-15]，目前已有不少学者基于核桃坚果表型性状进行遗传多样性的研究，但未见利用R语言进行其遗传多样性研究的相关报道。【本研究切入点】本研究将R语言应用于核桃种质资源坚果表型性状的调查与分析，旨在揭示能够鉴定核桃种质资源的有效表型性状指标。【拟解决的关键问题】为今后R语言应用于核桃遗传多样性研究提供新的数据分析方法，以期为今后采用形态学分析与分子标记技术相结合的方法挖掘优质核桃种质资源提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

以新疆核桃产区南疆盆地和田、喀什、阿克苏地区广泛收集的52份人工栽培的乡土核桃种质作为材料。其中，栽培品种42份，实生优良单株10份(表1)。

表1 供试核桃种质编号及名称

1.2 试验方法

1.2.1 坚果表型性状测定方法 针对每一份供试种质，在果实成熟期其盛果期植株上随机摘取成熟的果实10个，剥去外果皮得到的坚果晾干至恒重后测定其表型性状。首先，参考《植物新品种特异性、一致性、稳定性测试指南—核桃属》(GB/T26909-2011，2011)进行坚果表型质量性状指标测定，其中包括14个多态性性状指标，即：沿缝合线纵切面形状、垂直于缝合线纵切面形状、横切面形状、果基形状、果肩形状、果顶突出程度、脊分布、脊宽度、脊突出程度、脊旁凹槽深度、核壳颜色、核仁颜色、隔膜质地和內褶壁特征。然后针对完成表型质量性状指标测定后的每一份种质的坚果，进行坚果表型数量性状指标测定。坚果表型数量性状指标包括9个，即：单果重、出仁率、纵径、横径、侧径、核壳厚度、核仁粗脂肪含量、核仁粗蛋白含量和果形指数。其中，核仁粗脂肪含量测定采用索氏提取法[16]，核仁粗蛋白含量测定采用凯氏定氮法[17]。

1.2.2 数据分析方法 对坚果表型多态型指标与数量性状指标进行数据统计后，将其转变为虚拟变量，构建缺失(0)或存在(1)二元型数据矩阵，从而产生由74个表型性状(C1～C74)组成的原始矩阵(表2)。采用非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)对原始矩阵进行聚类分析，并对分类数量的稳定性进行锐度测试(10 000次迭代)，显着性水平为α=0.05，以确定最优分类等级；对其进行热图分析，最后采用多元回归树(multivariate regression trees，MRT)方法构建多元回归树，对能够区分供试种质的最少表型性状进行量化。

表2 核桃坚果表型性状观测指标

利用Microsoft Excel 2016进行原始数据的整理和计算；利用R语言对数据进行统计分析并作图。使用MULTIV v2.4软件进行群锐度化测试[18](Test of group sharpness)。

2 结果与分析

2.1 坚果表型多样性

从质量性状统计情况来看，供试种质坚果表型涵盖了坚果表型性状指标观测类型。从数量性状来看，供试核桃种质也呈现多样性(表3)：单果重(MN)的均值为15.95 g，变异系数为0.25，变异幅度为18.08～26.07 g；纵径(NL)的均值为44.17 mm，变异系数为0.13，变异幅度为31.67～56.60 mm；横径(NW)的均值为35.81 mm，变异系数为0.09，变异幅度为30.02～42.36 mm；侧径(NH)的均值为38.19 mm，变异系数为0.23，变异幅度为31.24～47.71 mm；果形指数(INS)的均值为1.20，变异系数为0.11，变异幅度为0.96～1.47；壳厚(HT)的均值为1.45 mm，变异系数为0.23，变异幅度为0.61～2.06 mm；出仁率的均值为45.69 %，变异系数为0.13，变异幅度为36.72 %～69.10 %；粗脂肪含量(CFC)的均值为62.43 %，变异系数为0.10，变异幅度为45.89 %～75.05 %；粗蛋白含量(CPC)的均值为17.56 %，变异系数为0.15，变异幅度为12.36 %～23.64 %。变异系数最大的指标为NW，最大值为26.07 g，最小值为8.00 g。

表3 核桃种质数量性状的变异分析

2.2 坚果表型聚类

基于供试核桃种质坚果表型进行聚类分析，以群锐度测试进行检验，结果发现可将其划分为2个不同的组(图1)：G1包括JR09、JR50、JR19、JR25、JR20、JR24、JR04、JR15、JR13、JR02、JR34、JR16、JR46、JR45、JR28、JR47、JR49、JR23、JR48、JR52、JR29、JR32、JR30、JR27、JR21、JR10、JR42、JR08和JR11共29份种质，其共同特征是单果重>15.0 g，侧径<35.78 mm；G2包括JR06、JR22、JR07、JR12、JR03、JR31、JR26、JR01、JR39、JR37、JR36、JR43、JR38、JR40、JR05、JR44、JR17、JR51、JR35、JR14、JR41、JR18和JR33共23份核桃种质，其共同特征是单果重<15.0 g，侧径>35.78 mm。

图1 基于核桃坚果表型的聚类分析(UPGMA)

针对G1群体再次进行锐度测试，将其分为11个亚群：G1′(JR09、JR50)、G2′(JR19、JR25)、G3′(JR20、JR24)、G4′(JR04)、G5′(JR15、JR13、JR02、JR34、JR16、JR46)、G6′(JR45、JR28)、G7′(JR47、JR49、JR23、JR48)、G8′(JR52)、G9′(JR29)、G10′(JR32、JR30)、G11′(JR27、JR21、JR10、JR42、JR08、JR11)；针对G2群体再次进行锐度测试，将其分为10个亚群：G12′(JR06)、G13′(JR22)、G14′(JR07、JR22)、G15′(JR03、JR31、JR26、JR01、JR39、JR37)、G16′(JR36、JR43、JR38)、G17′(JR38、JR40)、G18′(JR05、JR44、JR17、JR51、JR35)、G19′(JR14)、G20′(JR41、JR18、JR33)。

2.3 热图

根据对52份种质的坚果表型性状数据转化的二元矩阵，应用R语言进行聚类热图分析，将表型性状与种质分类结果直观展示，热图中性状缺失(0)用灰色表示，性状存在(1)则用红色表示(图2)。聚类热图结果与UPGMA聚类分析结果一致，性状缺失(0)或性状存在(1)将结果分为两大类。

从图2可以看出，52份种质坚果表型性状的分布共同集中的性状分布于内褶壁退化(C46)、横膈膜膜质(C44)、核仁黄色(C40)。G1群体中种质共同的坚果表型性状主要分布于单果重>15.0 g(C48)和侧径<35.78 mm(C55)；G2群体中种质共同的坚果表型性状主要分布于单果重8.0～15.0 g(C47)。同时表型性状在不同种质间的存在独特分布，单份种质中JR48与其他种质共有23个指标，其壳厚-厚壳(C64)性状与其他种质明显区分；JR38种质其沿缝合线纵切面三角形(C2)性状与其他种质明显区分；JR01种质其出仁率低(C65)性状与其他种质明显区分；JR52种质其内褶壁革质(C45)性状与其他种质明显区分。

图2 基于核桃坚果表型性状的聚类热图

2.4 多元回归树(MRT)

应用52份供试核桃种质核桃的74个坚果表型性状指标构建多元回归树，按照壳厚-厚壳(C64)这一性状为根节点开始划分，最后生成52个终结点树状分支(图3)。图3中性状存在(1)在右边分支，性状不存在(0)在左边分支，其中沿缝合线纵切面圆形(C1)、沿缝合线纵切面卵圆形(C3)、垂直于缝合线纵切面卵圆形(C7)、垂直于缝合线纵切面椭圆形(C8)、横切面圆形(C11)、脊分布上1/2(C25)、脊分布上2/3(C26)、脊分布贯通(C27)、单果重8.0～15.0 g(C47)、果形圆形(C58)、果形长圆(C59)、壳厚-纸皮(C61)、壳厚-薄壳(C62)、壳厚-厚壳(C64)、出仁率中(C66)共15个性状指标能够区分供试种质。即沿缝合线纵切面形状(C1～C5)、垂直于缝合线纵切面形状(C6～C10)、横切面形状(C11～C12)、脊分布(C25～C27)、单果重(C47～C48)、果形(C58～C60)、核壳厚度(C61～C64)、出仁率(C65～C68)是区分供试种质的重要性状。

图3 基于核桃坚果表型性状的多元回归树

3 讨 论

植物表型性状为植物遗传多样性的最直接反映，除了是衡量其遗传多样性的重要途径和关键指标[19]，还对揭示植物的基因型具有重要意义[20]，并对农林生产中品种选择与育种工作有重要影响。此外，在某些情况下，植物表型性状可以有效地进行园艺植物种质的鉴定与分类。如茎瘤芥(Brassicajunceavar.tumida)种质的菜叶形状、肉质茎和肉瘤形状[21]，紫苏(Perillafrutescens)种质的真叶颜色、叶型等[22]表型性状的差异均成为其鉴定分类的重要指标，明显的表型性状差异使得部分种质成为易于识别的特色种质。国内外在对核桃种质表型性状所表征的遗传多样性研究中，普遍采用核桃坚果性状指标，如巴基斯坦[23]、土耳其[24]、阿尔巴尼亚[25]等国乡土核桃品种的表型多样性分析。本研究中采用的26个坚果表型性状均为国内外相关文献中作为核桃种质分类的重要指标[26-27]，除此之外，本研究还将坚果品质性状(核仁粗脂肪、粗蛋白含量)同样作为种质鉴定的重要指标，对坚果表型质量性状与数量性状进行分析，结果发现供试种质具有丰富的表型多样性。

聚类分析的实质是综合考察大量性状指标，利用多元统计分析将供试对象分到相对同质的群组中的一种数学方法，已在植物表型性状的研究中获得良好效果，如有学者利用不同番茄(Lycopersiconesculentum)种质表型性状进行聚类找到性状突出、具有利用价值的新材料[28]，同时许多表型性状研究中所得聚类结果与传统分类结果及分子标记分类结果一致，证明基于表型性状的种质分类具有一定的遗传特征[29-30]。但聚类分析侧重于种质间关系差异的量化分析[31]，采用不同的聚类参数和聚类算法可能得到不同的分类结果，因此有学者提出群体锐度测试[32]来确定最佳的分类数量，这种方法已广泛应用于不同植物分类研究工作中，如菊科植物花粉分类研究[33]，以及巴西学者对胡椒科不同植物的分类[34]，目前并未有报道将其运用于园艺作物品种的分类鉴定工作。本研究中坚果表型性状聚类分析后的群体锐度测试得到明显区分的两个类群(G1、G2)，各类群中的种质具有相同的坚果性状。即使进行第二次锐度测试，G5′(6份种质)、G7′(4份种质)、G11′(6份种质)、G15′(6份种质)、G18′(5份种质)仍然各自聚为一类，说明从坚果表型角度考虑，其亲缘关系较近。此外，有少数种质间具有相同唯一性状，但它们并未组成明显的分类群体，其原因可能是聚类过程中更多考虑大部分种质共有的坚果性状。

聚类热图是将数据的相似性与差异性利用颜色的梯度及相似程度直观的表现出来的一种方法，广泛应用于基因表达量与基因表达的趋势研究中[35-36]，同时在遗传多样性研究中，被用于对聚类分析结果的验证，直观显示供试种质间亲缘关系远近及物种多样性信息[37-38]，而在表型多样性研究中应用较少。本研究中将表型性状的有无以热图的形式显示，能够直观表达供试种质间形态分化关系及不同种质间具有共有性状分布情况，为揭示种质鉴定中的重要表型性状提供重要信息。热图显示所有供试种质分为两大类，其分析结果与UPGMA聚类分析结果一致。表型性状在不同种质间的独特分布，能够显示出坚果表型性状对种质的区分情况，仅在少数种质中存在的表型性状是区分种质的重要性状。如沿缝合线纵切面三角形(C2)、内褶壁革质(C45)、壳厚-厚壳(C64)、出仁率低(C65)分别仅在JR38、JR52、JR48、JR01和4份种质中存在，因此认为核壳厚度、沿缝合线纵切面形状、出仁率、内褶壁等性状能够成为鉴定这4份核桃种质的重要表型性状指标。

多元回归树的构建会通过交叉验证对分类结果进行剪枝处理，尽量避免树过拟合的现象[39]，同时其构建过程，就是变量的选择过程。因此将MRT方法应用于构建种质间相关关系，不仅能够对其进行聚类，而且具有一定的预测功能[40-41]，在生态学领域应用较为广泛，如对环境因子与多物种分布的相关关系研究中，对植物群落进行合理地数量分类[42]。还有在海底鱼类群体生态学研究中，学者利用多元回归树量化环境对单一物种及海洋群落的影响[43]。本研究利用供试核桃种质坚果表型性状构建回归树，从MRT分类树状图中直观看出坚果表型性状与种质间的关系，C1、C3、C7、C8、C11、C25、C26、C27、C47、C58、C59、C61、C62、C64、C66共15个坚果表型性状被用于构建回归树，说明其对于供试种质的区分与鉴定贡献较大，而其余性质则因影响较小而未在回归树中出现。因此认为基于核桃种质表型性状鉴定种质中，沿缝合线纵切面形状、垂直于缝合线纵切面形状、横切面形状、脊分布、单果重、果形、核壳厚度、出仁率等性状是种质鉴定中重要的指标性状，这与以往的核桃种质表型性状研究结果一致[44-45]。此外，在分析中果形-圆形(C58)、壳厚-薄壳(C62)、出仁率-中(C66)等性状多次将供试种质分类，同样说明核壳厚度、出仁率等性状在核桃种质鉴定中的重要地位。

4 结 论

52份供试核桃种质坚果表型多样性丰富，沿缝合线纵切面形状、垂直于缝合线纵切面形状、横切面形状、脊分布、单果重、果形、核壳厚度、出仁率等性状是种质鉴定中重要的指标性状，研究结果为核桃种质资源基础理论研究与育种研究提供基础资料。此外，本文首次将R语言应用于坚果表型性状的聚类分析，热图分析及多元回归树建立，为今后R语言应用于核桃植物形态与遗传变异研究提供新的数据分析方法。