早期胰腺导管腺癌相关肿瘤标志物的筛选及临床意义*

李雪洁，崔大伟，滕晓东(浙江大学医学院附属第一医院.病理科,.输血科，杭州310003)

胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)是常见的恶性肿瘤之一，5年生存率仅为2%[1]。虽然切除术后PDAC患者具有较高的生存率，但多数患者就诊时已是晚期，仅有15%～20%的PDAC患者在发生早期病变时有手术机会[2]。糖类抗原19-9(CA19-9)作为临床上常用的PDAC诊断肿瘤标志物，其敏感性和特异性均不甚理想[3]。因此，迫切需要寻找更好的肿瘤标志物或多项肿瘤标志物联合检测，以提高早期PDAC的检出率。目前已报道的PDAC筛查肿瘤标志物种类繁多，非常有必要对候选肿瘤标志物进行系统性评估[4]。本研究拟通过筛选癌症基因图谱计划(TCGA)数据库，并对初步筛选的候选肿瘤标志物进行ELISA法检测，以期构建早期PDAC筛查的肿瘤标志物模型。

1 材料与方法

1.1研究对象 收集2018年10月至2019年12月浙江大学医学院附属第一医院肝胆胰外科就诊的PDAC患者100例，男65例，女35例，年龄38～79岁，中位年龄55岁。均按照PDAC诊断标准[5]明确诊断。纳入标准：(1)手术切除标本或B超引导下细针穿刺细胞学标本经病理组织学检查明确诊断；(2)B超、CT、MRI、逆行胰胆管造影(ERCP)、超声内镜(EUS)、经皮肝穿刺胆管造影(PTC)等证实胰腺有占位性病变。排除标准：(1)已接受放、化疗的患者；(2)同时患有严重的肝肾功能不全、糖尿病、感染、其他类型肿瘤；(3)非PDAC初诊患者。按照美国国立综合癌症临床实践指南[6]进行临床分期，分为早期PDAC 75例，中晚期PDAC 25例。相关疾病对照组收集同期就诊的30例慢性胰腺炎患者(按照慢性胰腺炎确诊标准[7]确诊)，男12例，女18例，年龄36～69岁，中位年龄52岁；以及30例胰腺良性囊肿患者(经病理组织学明确诊断为胰腺囊腺瘤)，男17例，女13例，年龄42～68岁，中位年龄55岁。另收集同期本院体检中心体检健康者40例作为健康人对照组，男17例，女23例，年龄28～55岁，中位年龄48岁。本研究通过浙江大学医学院附属第一医院医学伦理委员会审核批准(No.ZYYY-D-2019940)，所有研究对象均知情同意。

1.2标本采集 采集各研究对象治疗前的空腹静脉血(体检健康者于体检时采集)3 mL，EDTA-K2抗凝,2 000 r/min离心5 min，收集血清，于2 h内完成检测。

1.3主要试剂与仪器 CA19-9、白细胞激活粘附因子(ALCAM)、壳多糖酶3样蛋白(CHI3L1)、醛脱氢酶8A1融合蛋白(COL18A1)、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP2)、脂质运载蛋白2(LCN2)、亮氨酸糖蛋白1(LRG1)、溶菌酶(LYZ)、尼曼病蛋白2(NPC2)、帕金森氏病蛋白7(PARK7)、再生胰岛衍生蛋白3(REG3A)、分泌性白细胞蛋白酶抑制因子(SLPI)、组织蛋白酶S(CTSS)、血小板凝血酶蛋白1(THBS1)、组织金属蛋白酶抑制因子(TIMP1)、肿瘤坏死因子受体超家族成员1A(TNFRSF1A)和四二硫化物核心域蛋白2(WFDC2)ELISA检测试剂盒(美国Abcam公司)；Thermo Scientific Multiskan GO酶联仪(美国赛默飞世尔科技公司)。

1.4数据库筛选肿瘤标志物 收集TCGA数据库中所有可获取的近5年PDAC研究数据(2014年12月至2019年12月)。步骤：(1)登录TCGA数据库优化后的GEPIA数据库(www.gepia2.cancer-pku.cn)，选择癌肿类型为PAAD(胰腺导管腺癌在TCGA数据库中的样本代号)进行检索，网站输出突变的mRNA共计85个；(2)文献检索：在PubMed数据库检索对应时间(2014年12月至2019年12月)发表的PDAC研究，检索上述85个mRNA，并分析每个mRNA在PDAC和健康人组织中表达水平的高低(以表达量中位数为分界点)，以P<0.05为差异有统计学意义，共筛选出17个目标基因，分别为：CA19-9、ALCAM、CHI3L1、COL18A1、IGFBP2、LCN2、LRG1、LYZ、NPC2、PARK7、REG3A、SLPI、CTSS、THBS1、TIMP1、TNFRSF1A和WFDC2。

1.5ELISA法检测各肿瘤标志物 取各研究对象血清标本100 μL，按照上述17种肿瘤标志物ELISA检测试剂盒说明书检测，Thermo Scientific Multiskan GO酶联仪检测吸光度(A450 nm)值，绘制标准曲线，根据线性回归方程，计算各指标的浓度值。实验重复3次。各肿瘤标志物参考范围(ng/mL)分别为：CA19-9<5.2，ALCAM<3.4，CHI3L1<2.9，COL18A1<1.9，IGFBP2<4.8，LCN2<5.7，LRG1<2.3，LYZ<1.7，NPC2<2.3，PARK7<4.2，REG3A<3.1，SLPI<3.6， CTSS<2.4，THBS1<2.3，TIMP1<2.8，TNFRSF1A<2.9和WFDC2<4.1。

2 结果

2.1各组17种候选肿瘤标志物的表达水平 ELISA法检测结果表明，17种候选肿瘤标志物中有7种蛋白质(分别为IGFBP2、LRG1、CA19-9、REG3A、COL18A1、TIMP1和TNFRSF1A)在PDAC组中的表达水平显著高于相关疾病对照组及健康人对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 17种候选肿瘤标志物在各组中表达水平(ng/mL)的比较

2.27种肿瘤标志物在早期、中晚期PDAC患者血清标本中的比较结果 进一步分析表1中呈差异表达的7种肿瘤标志物在早期、中晚期PDAC患者血清标本中的表达水平，结果发现CA19-9、 TIMP1、LRG1在两组中的差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 7种肿瘤标志物在早期、中晚期PDAC患者血清中的表达(ng/mL)

2.3CA19-9、 TIMP1、LRG1单独及联合检测对早期PDAC的诊断效能 以早期PDAC患者作为疾病组，非PDAC患者 (健康人对照组、良性囊肿患者、慢性胰腺炎患者)作为对照组，经二元Logistic回归分析，3种肿瘤标志物与诊断早期PDAC的相关程度见表3。建立的Logistic回归模型为：ln[P/(1-P)]= 0.412× TIMP1+0.054×LRG1+25.6×CA19-9-14.4，计算出每个样本的P值，得到预测概率。绘制ROC曲线，该预测概率的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.950，结果见图1和表4。分别以CA19-9>38.2 ng/mL、TIMP1>21.9 ng/mL、LRG1>16.9 ng/mL、三者联合的预测概率>60%作为cut-off值，3种肿瘤标志物联合检测诊断早期PDAC的敏感性、特异性及准确性均高于单独检测和两两联合检测。见表4。

表3 3种肿瘤标志物的Logistic回归分析结果

表4 CA19-9、TIMP1和LRG1单独及联合检测对早期PDAC的诊断效能比较

3 讨论

本研究首先从数据库中检索并初步筛选出17个目标基因(CA19-9、ALCAM、CHI3L1、COL18A1、IGFBP2、LCN2、LRG1、LYZ、NPC2、PARK7、REG3A、SLPI、CTSS、THBS1、TIMP1、TNFRSF1A和WFDC2)，与Kim等[8]的研究结果相比少了3个(分别为MMP2、MMP10和THBS2)，较Song等[9]的研究结果相比少了6个(OPG、OPN、ICAM-1、SAA、ApoA1、CEA和CRP)。可能是由于限定条件不完全相同，导致初步目标基因数量略有差异，但本研究与上述文献均重叠了这17个目标基因，由此可见这些基因可能作为筛选早期PDAC的潜在肿瘤标志物。

本研究采用ELISA法进一步验证在PDAC患者血清标本中存在明显差异的7种肿瘤标志物(IGFBP2、LRG1、CA19-9、REG3A、COL18A1、TIMP1和TNFRSF1A)，这7种肿瘤标志物在健康人群或相关疾病对照者血清中含量较低，能较好地用于疾病的区分。Root等[10]检测了30例PDAC患者、20例健康人和10例慢性胰腺炎患者血清标本中7种与本研究相同的候选生物学标志物，结果发现这7种蛋白质的表达差异均具有统计学意义。其与本研究结果仅存在表达水平的差异，可能是地域和人群选择，亦或是样本类型(血清)、储存和测定条件(试剂和ELISA选择)等造成的结果差异。

本研究应用Logistic回归模型并结合ROC曲线分析在早期与中晚期PDAC患者血清中表达差异的3种肿瘤标志物(CA19-9、TIMP1、LRG1)，并进一步分析其在早期PDAC诊断中的临床意义，结果发现该3种标志物联合检测诊断早期PDAC患者的AUCROC、敏感性、特异性和准确性均高于任一肿瘤标志物单项检测及两两联合检测，提示该3种标志物联合检测可有效提高早期PDAC检出率。本研究的不足之处是纳入的早期PDAC患者例数偏少，且缺少癌前病变患者，后续研究中应继续增加相应的标本量。此外，仍需要进一步对肿瘤标志物组合进行严格验证，并除去循环蛋白质之外的其他类型肿瘤标志物的干扰，以进一步提高早期PDAC的诊断效能。