丹参提取物抑制高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞凋亡的机制研究

权联姣 秦婧婧 权元鼎

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病常见的微血管并发症之一，其发病机制尚未完全明确，炎症反应、凋亡、氧化应激等与其密切相关[1-2]。丹参是一种传统的中药，具有抗炎、抗氧化、抗血栓、免疫调节等作用[3]。有关研究发现丹参及其制剂在DR的治疗过程中发挥重要作用[4-5]，但其机制目前尚不清楚。本研究采用高糖处理人视网膜血管内皮细胞(HRECs)构建DR体外的细胞模型，探讨丹参提取物对HRECs凋亡的影响及其作用机制。

材料与方法

1.材料：HRECs购自美国菌种保藏中心(ATCC)细胞库；丹参购自哈尔滨市同仁堂大药房；杜氏贝科改良伊格尔培养基(DMEM)购自美国HyClone公司；胰蛋白酶、胎牛血清购自美国Gibco公司；细胞计数试剂盒(CCK-8)、二辛可宁酸(BCA)试剂盒购自碧云天生物技术研究所；膜联蛋白(Annexin)Ⅴ-FITC/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒购自日本TaKaRa公司；肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和IL-8酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3兔单克隆抗体、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)兔单克隆抗体、Bcl-2兔单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；核因子(NF)-κB兔单克隆抗体、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)兔单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G购自美国Abcam公司。

2.方法

(1)丹参提取物的制备：参照文献[6]中制备丹参提取物的方法，将丹参40 ℃烘干，粉碎成干粉，然后加入10倍水于80 ℃提取2次，每次提取30 min。过滤，弃去滤渣，合并滤液，过滤，将溶液定容至100 mL，以2 000 r/min离心10 min，上清即为丹参提取物。

(2)细胞培养方法和分组情况：将冻存的HRECs常规复苏，接种到含10%胎牛血清、5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基中，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞贴壁生长汇合率达80%以上时以胰蛋白酶消化进行传代培养。将对数生长期细胞分为5组，5.5 mmol/L葡萄糖培养的细胞作为对照组，30.0 mmol/L葡萄糖培养的细胞作为高糖组[7]，30.0 mmol/L葡萄糖和5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml丹参提取物培养的细胞作为丹参提取物低、中、高浓度组。

(3)CCK-8法检测HRECs活性：5组细胞培养48 h后向每孔细胞中加入10 μl CCK-8溶液，在37 ℃下继续培养4 h，酶标仪检测波长570 nm处细胞光密度值(OD值)，以OD值反映细胞活性。重复试验3次，取平均值。

(4)流式细胞术检测HRECs凋亡率：各组细胞培养48 h后用预冷的磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞，取100 μl 1×结合缓冲液重悬细胞，加入Annexin Ⅴ-FITC溶液5 μl，混匀后避光反应10 min，再加入PI染液5 μl，混匀后避光孵育20 min，最后加入400 μl 1×Binding Buffer结合缓冲液，立即上流式细胞仪测定，分析细胞凋亡率。重复试验3次，取其平均值。

(5)ELISA检测炎症因子含量：分别收集处理48 h的HRECs上清液，分别参照TNF-α、IL-1β和IL-8 ELISA检测试剂盒说明书测定TNF-α、IL-1β和IL-8的含量。重复试验3次，取其平均值。

(6)蛋白质印迹法(Western blot)检测HRECs中蛋白表达水平：5组HRECs处理48 h后，提取细胞总蛋白，使用BCA试剂盒进行定量分析。将蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳电转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，在5%脱脂奶粉中封阻2 h，TBS缓冲液加吐温(TBST)洗膜后加入一抗(Caspase-3一抗1∶500稀释，Bax一抗1∶500稀释，Bcl-2一抗1∶500稀释，NF-κB一抗1∶800稀释，p-NF-κB一抗1∶800稀释)，在4 ℃下过夜杂交。TBST洗膜后再加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶3 000稀释)，于室温下杂交2 h，TBST洗膜后，采用电化学发光(ECL)发光液显影，转移至暗室采集图像，使用Image J软件分析条带灰度值，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内标，计算各组HRECs中目的蛋白相对表达水平。

结 果

1.5组HRECs活性比较：CCK-8检测结果显示，高糖组HRECs的OD值较对照组明显降低(P<0.05)；与高糖组比较，丹参提取物低、中、高浓度组HRECs的OD值均依次升高(P<0.05)。见图1。

注：与对照组比较，aP<0.05；与高糖组比较，bP<0.05；与低浓度组比较，cP<0.05图1 5组HRECs的活性比较结果

2.5组HRECs凋亡率比较：流式细胞术检测结果显示，与对照组比较，高糖组HRECs凋亡率明显升高(P<0.05)；与高糖组比较，丹参提取物低、中、高浓度组HRECs凋亡率均明显依次降低，各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：与对照组比较，aP<0.05；与高糖组比较，bP<0.05；与低浓度组比较，cP<0.05；与中浓度组比较，dP<0.05图2 5组HRECs凋亡率比较

3.5组HRECs中凋亡相关蛋白表达比较：Western blot检测结果显示，与对照组比较，高糖组HRECs中Caspase-3和Bax蛋白表达明显升高，Bcl-2蛋白表达明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)；与高糖组比较，丹参提取物低、中、高浓度组HRECs中Caspase-3和Bax蛋白表达明显依次下降，Bcl-2蛋白表达明显依次升高，各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3。

注：与对照组比较，aP<0.05；与高糖组比较，bP<0.05；与低浓度组比较，cP<0.05；与中浓度组比较，dP<0.05图3 5组HRECs中凋亡相关蛋白表达比较 A：Caspase-3蛋白；B：Bax蛋白；C：Bcl-2蛋白；D：Western blot检测结果

4.5组HRECs炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-8含量比较：ELISA检测结果显示，与对照组比较，高糖组HRECs上清液中TNF-α、IL-1β和IL-8含量明显升高(P<0.05)；与高糖组比较，丹参提取物低、中、高浓度组HRECs上清液中TNF-α、IL-1β和IL-8含量明显依次降低，各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见图4。

注：与对照组比较，aP<0.05；与高糖组比较，bP<0.05；与低浓度组比较，cP<0.05；与中浓度组比较，dP<0.05图4 5组HRECs中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-8含量比较 A：TNF-α；B：IL-1β；C：IL-8

5.5组HRECs p-NF-κB蛋白表达比较：Western blot检测结果显示，与对照组比较，高糖组HRECs中p-NF-κB蛋白表达升高(P<0.05)；与高糖组比较，丹参提取物低、中、高浓度组HRECs中p-NF-κB蛋白表达依次下降，各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见图5。

注：与对照组比较，aP<0.05；与高糖组比较，bP<0.05；与低浓度组比较，cP<0.05；与中浓度组比较，dP<0.05图5 5组HRECs p-NF-κB蛋白表达比较A：5组HRECs NF-κB和p-NF-κB蛋白表达水平比较；B：5组HRECs NF-κB和p-NF-κB蛋白表达水平比较

讨 论

研究发现，丹参提取物具有抗炎、抗氧化等作用，在治疗DR中取得了较好的疗效[8]。本研究结果发现，高糖诱导的HRECs活力明显降低，且凋亡率明显升高，提示高糖能够诱导细胞凋亡，参与DR过程。这与近期关于DR患者存在微血管内皮细胞凋亡的研究结果相符[9-11]。不同浓度的丹参提取物均可提高高糖诱导的HRECs活性，抑制高糖诱导的细胞凋亡，且具有浓度依赖的关系，提示丹参提取物对高糖诱导的HRECs具有保护作用。Bax和Bcl-2均属于Bcl-2基因家族成员，Bax是促凋亡基因之一，其过度表达可引起Bcl-2对细胞保护效应的失衡。当细胞受到损伤后，Bcl-2构象发生改变，引起线粒体释放细胞色素C，进而激活下游的Caspase-3级联反应，引发细胞凋亡[12-13]。本研究结果显示，高糖能够诱导Caspase-3和Bax蛋白高度表达，Bcl-2蛋白表达下调，而丹参提取物能够降低Caspase-3和Bax蛋白表达水平，提高Bcl-2蛋白表达水平，提示丹参提取物可通过阻碍Bcl-2构象改变，抑制Caspase-3级联反应，从而抑制细胞凋亡。

NF-κB是转录因子蛋白家族成员之一，在免疫、炎症反应及细胞生长发育过程中起重要作用[14]。有关研究结果显示，NF-κB信号通路能够调控下游基因Bax和Bcl-2的表达，参与细胞凋亡过程[15]。丹参可通过抑制NF-κB信号通路参与肝癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的过程[16]。本研究结果显示，高糖能够促进Bax蛋白的表达，而丹参提取物能够抑制高糖诱导的Bax蛋白的表达，提示丹参提取物可能通过抑制NF-κB信号通路的激活抑制高糖诱导的HRECs凋亡。有研究结果表明，NF-κB通过调控细胞因子、趋化因子等参与调节机体炎症反应，NF-κB的过度激活是炎症反应发生的关键环节[17-18]。丹参可通过调控NF-κB信号通路进而调控炎症因子和黏附因子等的表达，影响细胞功能[19-20]。本研究结果显示，高糖诱导的细胞炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-8的含量明显增多，丹参提取物处理后TNF-α、IL-1β和IL-8的含量明显减少，提示丹参提取物可能通过抑制NF-κB信号通路的激活降低炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-8分泌，从而抑制细胞凋亡。本研究仅对丹参提取物影响NF-κB信号通路的作用机制进行了初步探究，涉及该通路上游或下游基因表达情况的检测尚显不足，后续研究将对此进行补充。

综上所述，丹参提取物可抑制高糖诱导的HREOS凋亡，其作用机制可能是抑制NF-κB信号通路的激活，通过上调Bcl-2蛋白表达，下调Caspase-3和Bax蛋白表达，降低炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-8分泌来实现的。提示丹参提取物可通过抑制NF-κB信号通路，对抗炎症反应，降低细胞凋亡从而起保护HREOS的作用。