银杏花粉离体萌发培养基的优化

曾祥久

(丹东坤霖林业服务有限公司，辽宁 丹东 118200)

银杏Ginkgobiloba是银杏科唯一的植物，我国独一无二的经济林树种。因其用途多样，在造林、制药和保健中具有举足轻重的经济价值和研究价值[1-2]。在银杏常规杂交育种实践中，花粉作为遗传信息的载体传递给母本来选育优质杂交后代[3]。父本自身花粉活力的大小对育种工作有着直接的影响[4]。因此，研究其花粉萌发特性对育种工作具有积极意义。虽然前人对银杏花粉的离体萌发开展了一些研究，但是其所使用的培养基配方比较复杂，花粉萌发的培养时间也比较长。因此，寻找一种适宜而简单的培养基用于银杏花粉离体萌发是非常必要的。本研究旨在通过蔗糖、硼和钙离子这3种重要的营养成分对银杏花粉萌发的影响，优化花粉萌发培养基成分，为后续杂交育种中花粉生活力测定提供一套简单易行的方法。

1 材料与方法

1.1 材 料

试材为银杏花粉。2017年4月21日在丹东市采集带有花序的枝条，放在有冰袋的保温盒内带回实验室。取下花药于阴凉干燥处放置1 d后采集花粉。用500目细筛筛选花粉，放置于1.5 mL离心管内，-20 ℃保存备用。

1.2 方 法

基本培养基含0.7%琼脂、0.1%硝酸钾、0.2%硫酸镁。添加蔗糖、硼酸和氯化钙后，培养基于121 ℃高压蒸汽灭菌15 min，在直径60 mm培养皿内倒一薄层培养基。将花粉均匀撒播在冷却的培养基上，放在25 ℃恒温恒湿箱5 d。在显微镜下随机选取5个花粉数大于30的视野，统计萌发率，重复3次。

1.2.1 单因子试验

在基本培养基中加入蔗糖，质量浓度分别为0、50、100、150、200 g·L-1；在基本培养基中加入硼酸，质量浓度分别为0、10、20、40、60、80、100 mg·L-1；在基本培养基中加入氯化钙，质量浓度分别为0、10、20、40、60、80、100 mg·L-1。测定不同处理的花粉萌发率。

1.2.2 正交试验

在单因子试验基础上，对蔗糖、硼酸、氯化钙3因子进行正交试验，如表1。测定不同处理的花粉萌发率。

1.3 数据处理

使用SPSS 20.0软件处理数据，并进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 单因素对银杏花粉萌发的影响

2.1.1 蔗糖对银杏花粉萌发的影响

从表2可以看出，花粉在蔗糖质量浓度50 g·L-1的培养基，萌发率较对照显著提高；当质量浓度为100 g·L-1时，萌发率达到最高14.67%，为对照的2.6倍；而当质量浓度达到150、200 g·L-1时，萌发率较50 g·L-1和100 g·L-1时明显下降。方差分析表明，蔗糖质量浓度为50 g·L-1和100 g·L-1时萌发率无显著差异(P>0.05)。可见，适宜蔗糖质量浓度明显促进了银杏花粉萌发，高于适宜浓度其作用明显降低。

2.1.2 硼酸对银杏花粉萌发的影响

从表3可以看出，当硼酸质量浓度为10 mg·L-1和20 mg·L-1时，花粉萌发率较对照显著提高，但两者间差异不显著(P>0.05)。当质量浓度达到20 mg·L-1时，萌发率达到最高值10.31%，为对照的1.8倍；当质量浓度为60、80、100 mg·L-1时，花粉萌发率逐渐降低，可见花粉萌发受到了抑制。

表1 L25(53)正交试验设计

表2 蔗糖对银杏花粉离体萌发的影响

表3 硼酸对银杏花粉离体萌发的影响

2.1.3 氯化钙对银杏花粉萌发的影响

从表4可以看出，当氯化钙质量浓度为10～40 mg·L-1，随着浓度升高萌发率也升高；氯化钙质量浓度为40 mg·L-1时，萌发率最高18.43%，为对照的3.2倍；当质量浓度为100 mg·L-1时，萌发率显著降低，说明花粉萌发受到了抑制。方差分析表明，硼酸40 mg·L-1的萌发率与其他质量浓度下的花粉萌发率存在显著差异(P<0.05)。

表4 氯化钙对银杏花粉离体萌发的影响

2.2 正交试验对银杏花粉萌发的影响

银杏花粉离体萌发正交试验结果见表5。

方差分析表明，蔗糖、硼酸、氯化钙均能显著促进银杏花粉萌发(P<0.05)。100 g·L-1蔗糖、10 mg·L-1硼酸、40 mg·L-1氯化钙的花粉萌发率最高，即表1中12号处理，且与其他处理差异显著(P<0.05)。因此，银杏花粉最佳培养基组分为：100 g·L-1蔗糖、10 mg·L-1硼酸、40 mg·L-1氯化钙。

表5 银杏花粉离体萌发正交试验

3 讨 论

离体培养法是目前一种常用的花粉生活力测定方法,其培养基主要成分包括蔗糖、硼和钙离子。蔗糖为花粉萌发提供必需的碳源和氮源，它不仅在花粉管壁合成中发挥着重要作用[5]，还为花粉的代谢提供物质补充，并平衡着花粉萌发过程中的渗透压。硼在参与花粉管膜的合成和氧的吸收[6]，授粉过程中，花粉中硼含量低，需要从柱头中吸收，必要时需喷施含硼的营养液。因此，在育种实践中，花期应喷施含硼的营养液辅助受精过程，注意浓度不宜过高。钙离子则是植物代谢重要的调控因子[7]，是花粉发育必不可少的金属元素。从本研究可以看出，在适宜的质量浓度范围内，蔗糖、硼和钙离子3种营养成分均促进银杏花粉的萌发，过高质量浓度反而在不同程度上抑制花粉萌发，这与胡君艳[8]的研究一致，说明过高质量浓度打破了花粉的内外渗透压，从而影响了养分的吸收。