小麦种质资源BJ399抗条锈病基因的分子标记定位

周喜旺，刘鸿燕，王 娜，魏志平，王晓明，张耀辉，岳维云，汪石俊，曹世勤，宋建荣

(1.天水市农业科学研究所，甘肃天水 741001； 2.甘肃省农业科学院植物保护研究所，甘肃兰州 730070)

小麦条锈病是由专性寄生菌条形柄锈菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的全世界范围内小麦上的最主要病害，小麦条锈菌新小种的出现是导致小麦品种抗锈性丧失的主要原因[1]。目前，新毒性小种CYR34已成为甘肃省的第一流行小种[2-3]，使甘肃陇南小麦生产上利用的含有Yr10和Yr26基因的抗源或品种抗病性逐渐丧失[4-5]，而新的抗源材料又严重缺乏，因此，发掘新抗源并加以有效利用，对控制该区小麦条锈病发生流行及小麦安全生产具有重要意义。

迄今为止，国际上已在82个位点正式命名了85个抗条锈病基因[6](Yr1～Yr82，其中Yr3有3个等位基因，Yr4有2个等位基因)，如Yr65[7]、Yr76[8]、Yr78[9]和Yr80[10]等为近年定位的抗病基因。由于小麦条锈病菌的高度变异性, 许多曾在小麦生产上发挥重大作用的抗病基因已丧失抗性，目前仅有全生育期抗锈基因Yr5、Yr15和Yr61对当前条锈菌流行小种CYR32、CYR33和CYR34具有一定的抗病性[11]，成株期抗锈基因Yr18具有相对持久的抗条锈性[12-13]。分子标记技术的发展，为抗病基因的检测、标记及定位提供了可能，其中SSR标记由于其位点丰富、操作简单、重复性好、多为共显性、实验成本低等诸多优点[14]，被广泛应用于小麦抗病基因定位和分子标记辅助育种。

小麦种质资源BJ399是中国农业科学院作物所从欧洲引进的普通小麦品种，农艺性状优良。在天水市农业科学研究所甘谷试验站经连续多年田间抗病性鉴定，发现该品种整个生育期对田间自然诱发的条锈病表现免疫至近免疫，对白粉病表现高抗。基于此，本研究利用条锈菌生理小种CYR34对其杂交后代群体进行遗传分析和抗条锈病基因染色体定位，旨在明确BJ399的抗条锈病遗传基础，为该抗源在甘肃陇南地区的有效利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

利用抗条锈病材料BJ399和感病品种铭贤169配制杂交组合，分别获得F1、F2和BC1代材料，以上材料均由天水市农业科学研究所中梁试验站提供；供试菌种为生理小种CYR34的单孢菌系，由甘肃省农业科学院植物保护研究所小麦病害课题组提供。

1.2 苗期条锈病抗性鉴定

将试验材料播于白色塑料钵内，待幼苗长至2叶1心期，采用抖孢子粉法接种条锈菌单孢菌系CYR34，接种后幼苗置于10 ℃黑暗条件下保湿24 h，之后置于温室(平均温度12～18 ℃，光照10～12 h/d，光强5 000～8 000 lx)诱导发病，待感病对照品种铭贤169充分发病后，调查亲本和后代材料的反应型，反应型记载采用0、0；、 1、 2、3、4共6级标准进行[15]。用卡方测验进行适合度检测，以明确BJ399对生理小种CYR34的抗病基因数、互作方式及抗病特点。

1.3 基因组DNA的提取和抗感池的构建

采用改良的CTAB法[16-17]提取两亲本和F2代分离群体单株的基因组DNA。用分离群体分组分析法(bulked segregation analysis，BSA)鉴定与抗病基因连锁的微卫星标记。根据抗病性鉴定结果，建立抗感池，将10株高抗单株DNA等量混合构成抗病池，10株高感单株DNA等量混合构成感病池。

1.4 SSR分析

小麦SSR引物根据Röder等[18]、Pestsova等[19]、Song等[20]和Somers等[21]报道的序列从https://wheat.pw.usda.gov网站查找并由北京赛百盛公司合成，以抗病亲本、感病亲本、抗病池、感病池的DNA为模板筛选SSR引物，寻找在抗病亲本、抗病池、感病亲本、感病池间有多态性的引物，进一步将多态性引物在F2代分离群体中分析验证，检测SSR标记与抗病基因的连锁程度。初步确定抗病基因所在染色体位置后，再选取其所在基因组区域的其他SSR引物进一步筛选多态性。

PCR扩增反应总体系为10 μL，其中5 μL 2×MasterMix(天根生化科技有限公司)、2 μL ddH2O、上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL(50 ng·μL-1)。扩增程序为：94 ℃预变性4 min； 94 ℃变性50 s，58～62 ℃退火50 s(依据引物的退火温度)，72 ℃延伸50 s，共35个循环；最后 72 ℃延伸10 min。扩增产物经8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、硝酸银染色后置于胶片观察灯上照相。

1.5 遗传距离估算和连锁分析

用JoinMap 4.0软件计算SSR分子标记与抗条锈病基因之间的遗传距离，用MapDraw V2.1软件绘制该基因的遗传连锁图谱。

2 结果与分析

2.1 BJ399对条锈病的抗性鉴定结果和遗传分析

表1 BJ399对条锈菌小种CYR34的抗性遗传分析Table 1 Genetic analysis of resistance to CYR34 in wheat germplasm BJ399

2.2 抗条锈病基因 YrBJ399的分子标记定位 结果

随机选取分布在整个小麦基因组上的400对SSR引物分别在抗病亲本BJ399、感病亲本铭贤169、抗病池和感病池DNA上进行PCR扩增，结果发现位于2AS染色体上的SSR标记Xgwm425在抗、感亲本和抗、感池间存在多态性，用Xgwm425分别在10株纯合抗病株和10株纯合感病株上进行小群体上验证，发现标记Xgwm425和抗病基因YrBJ399有连锁关系。进一步选取2AS染色体上的其他SSR标记进行检测，发现标记Xwmc296和Xgwm558均具有多态性，分别将这3个SSR标记(表2)在F2分离群体上进行检测，发现均与YrBJ399存在连锁关系，且3个标记都为共显性标记，在F2代群体上的分离均符合1∶2∶1的孟德尔遗传(表3)。标记Xwmc296和Xgwm425在BJ399/铭贤169分离群体部分单株上的扩增结果见图1和图2。

表2 与BJ399抗条锈病基因连锁的分子标记引物序列Table 2 SSR primer sequences linked with stripe rust resistant gene derived from BJ399

表3 SSR标记在(BJ399×铭贤169)F2代群体的分离Table 3 Segregation ratios of SSR markers in(BJ399×Mingxian 169) F2

M:50 bp ladder; 1:BJ399; 2:铭贤169; 3:抗病池; 4:感病池; 5～9:纯合抗病单株; 10～13:杂合单株; 14～18:纯合感病单株。

M:50 bp ladder; 1:BJ399; 2:铭贤169; 3:抗病池; 4:感病池; 5～9:纯合抗病单株; 10～14:杂合单株; 15～19:纯合感病单株。

2.3 连锁分析

利用JoinMap 4.0软件对3个SSR标记位点与抗条锈病基因YrBJ399连锁分析，结果表明3个标记都位于抗病基因YrBJ399的一侧，抗病基因和分子标记在染色体上的排列顺序为YrBJ399-Xwmc296-Xgwm425-Xgwm558，最近标记Xwmc296与抗条锈病基因YrBJ399的遗传距离为9.5 cM，标记Xgwm425与抗条锈病基因YrBJ399的遗传距离为14.3 cM，由于3个SSR标记均位于小麦2AS染色体上，因此，抗病基因YrBJ399被初步定位于2AS染色体上，靠近着丝点。据此绘制抗条锈基因YrBJ399的遗传连锁图(图3)。

图3 抗条锈基因 YrBJ399 的遗传连锁图谱

3 讨 论

本研究对种质资源BJ399的遗传分析表明，BJ399对目前中国条锈菌流行小种CYR34具有良好的抗病性，是一个优异的抗病种质资源，BJ399对CYR34的抗锈性由1对显性基因控制，该基因暂命名为YrBJ399, 利用SSR分子标记筛选到3个与目标基因连锁的标记Xwmc296、Xgwm425和Xgwm558，初步将抗病基因YrBJ399定位到染色体2AS上，并构建了分子标记连锁 图谱。

目前定位于小麦2AS染色体上的抗条锈基因有Yr17、YrElm1-4、YrZL16、YrZM175、YrCH5026、YrSph和YrR61等。Yr17[22-23]来源于偏凸山羊草，已被转育到普通小麦品系VPM1中；YrElm1-4来源于柔软滨麦草，杨敏娜等[24]将YrElm1-4定位到2AS，距其最近的SSR标记Xwmc522的遗传距离为5.9 cM；马东方等[25]将中梁16中的抗锈基因YrZL16定位到2AS，与SSR标记 Xbarc212和Xwmc177紧密连锁，遗传距离分别为5.4 cM和6.6 cM，并推测YrZL16来源于水源11；Lu等[26]推测YrZM175来源于BPM27，距其最近的SSR标记Xgwm636的遗传距离为4.9 cM；侯丽媛等[27]在小麦与中间偃麦草渗入系CH5026中发现抗病基因YrCH5026，并判断YrCH5026来源于中间偃麦草Z1141，与其紧密连锁的标记为Xwmc382和Xgpw7101；YrSph[28]来源于印度圆粒小麦，为隐性基因；YrR61[29]来源于美国软红冬麦，为成株期抗病基因。而种质资源BJ399起源于欧洲，属普通小麦品种(张学勇，私人通讯)。从抗病基因来源看，YrBJ399是不同于Yr17、YrElm1-4、YrZL16、YrZM175、YrCH5026、YrSph及YrR61的抗病基因。

从抗病基因所在染色体位置分析，YrElm1-4位于标记Xgwm636和Xwmc522区间，YrZL16位于标记 Xbarc212和Xwmc177区间，YrZM175位于标记Xwmc382和Xgwm636区间，标记 Xbarc212和Xwmc177、Xwmc382和Xgwm636都位于2AS中上部，标记Xgwm636和Xwmc522位于2AS中部[21]。YrCH5026和YrBJ399虽都位于2AS着丝粒附近，但YrCH5026位于标记Xwmc382和Xgpw7101区间，与标记Xwmc382的遗传距离为6.0 cM，YrBJ399与最近标记Xwmc296的连锁距离为9.5 cM，SSR标记Xwmc382与Xwmc296的相对遗传距离为33.0 cM[21]，故YrCH5026与YrBJ399明显不同。此外，用与YrElm1-4、YrZL16、YrZM175、YrCH5026连锁的标记在本研究的抗感亲本、抗感池上进行扩增，在抗感亲本和抗感池间均无多态性。Yr17单基因系苗期接种CYR34，其抗病性表现为中抗(反应型2)，而BJ399对CYR34的抗病性表现为免疫或近免疫。综合以上结果，推测BJ399所含的2AS上的抗条锈病基因YrBJ399与已知的Yr基因不同，可能为新的抗条锈病基因。

CYR34对Yr10和Yr26具有联合毒性，该小种的发展对我国各主要麦区尤其甘肃陇南麦区的小麦生产构成严重威胁[5]。对国外引进的重要抗源材料进行抗病基因组成和抗病特点研究，是合理利用抗病品种的基础[30]。在当前优势小种CYR34的流行压力下，BJ399对CYR34表现出良好的抗病性，因此是一个具有巨大应用潜力的抗源材料，在小麦抗条锈病育种中应合理利用。由于本研究中所获得的标记与抗病基因的遗传距离较远，需继续寻找与抗病基因连锁更为紧密的标记，以便更好地应用于分子标记辅助育种中。