不同中药乙醇提取物对酪氨酸酶抑制活性的比较

2020-07-31张国哲刘平平季禹乔

中国医药导报 2020年16期

张国哲刘平平季禹乔

[摘要] 目的对几味中药醇提物的美白活性进行研究，为开发中药美白产品提供实验依据。方法高良姜、白及、白芷、苏木、白术、紫草、艾叶、马齿苋、诃子9味中药采用70%乙醇提取方法，以维生素C和熊果苷为阳性对照，采用体外酪氨酸酶抑制法实验，比较不同药物的活性差异。结果中药诃子酪氨酸酶抑制率为（51.43±2.52）%，高于熊果苷的（46.34±6.32）%。中药艾叶和马齿苋也有一定的抑制酪氨酸酶作用，抑制率分别为（22.88±7.99）%和（13.07±11.98）%。而其他几味中药几乎没有抑制酪氨酸酶作用。结论中药诃子、艾叶醇提物对酪氨酸酶有一定的抑制活性，可作为美白中药进一步研究。

[关键词] 美白;酪氨酸酶;中药;熊果苷

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2020）06（a）-0034-04

[Abstract] Objective To study the whitening activity of ethanol extracts of several traditional Chinese medicine， and to provide experimental basis for the development of whitening products of traditional Chinese medicine. Methods Nine traditional Chinese medicine including lesser galangal rhizome， common bletilla rubber， dahurian angelica root， sappan wood， largehead atractylodes rhizome， Radix Arnebiae， argy wormwood leaf， purslane herb， and medicine terminalia fruit were extracted with 70% ethanol. Vitamin C and arbutin were used as positive control drugs. In vitro tyrosinase inhibition test was employed to compare the bioactivity of different drugs. Results The inhibition rate of traditional Chinese medicine medicine terminalia fruit was （51.43±2.52）%， was higher than （46.34±6.32）% of arbutin. Artemisiae Argyi， Herba Portulacae also have good tyrosinase inhibity， the inhibition rates were （22.88±7.99）% and （13.07±11.98）%， respectively. However， the other Chinese medicine hardly inhibited tyrosinase activity. Conclusion The ethanol extracts of medicine terminalia fruit and argy wormwood leaf have certain inhibitory activities on tyrosinase， which can be further studied as whitening tradiational Chinese medicine.

[Key words] Whitening; Tyrosinase; Traditional Chinese medicine; Arbutin

随着社会的发展，人们对美的追求已经从传统的日化护肤品向纯天然的功能化妆品转变。美容中药及化妆品、护肤品在我国发展历史悠久，早在《五十二病方》中就已经记载了8首有关美容相关的方剂。也有诸多中医药古籍关于美白中药的记载。

由于中药毒副作用小，使用后效果明显，越来越受到广大消费者的欢迎。因此，研究开发中药美容护肤品不仅可以满足市场的需求，也对挖掘中医药宝库、发扬光大我国传统中医药十分有益。中医药美白、祛斑等产品以日本、韩国和台湾发展较为迅速，市售的许多美白、祛斑产品都是通过抑制酪氨酸酶活性，减少黑色素的形成而达到美白的功效[1]，药物的美白作用强弱可以通过测定其对酪氨酸酶抑制率作为主要评价指标[2-4]。美白药物的筛选实验最常用的是酪氨酸酶抑制试验，方法成熟，结果可靠[5-7]。然而，单纯注重美白还不够，痤疮、粉刺、脱发、龋齿等疾病多与微生物滋生有关，因此也应当关注抑菌中药的美白作用。本研究主要通过体外实验，利用酪氨酸酶活性抑制实验，观察高良姜、白及、白芷、苏木、白术、紫草、艾叶、马齿苋、诃子几味传统的美白及抗菌消炎中药的美白活性，为开发中药美白化妆品提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

熊果苷、L（+）-抗壞血酸（台湾第一化工原料股份有限公司）;酪氨酸酶（美国Sigma公司，货号：076K7034， 5771 U/mg）;酪氨酸（美国Sigma公司，货号：145726， 98%）;KH2PO4、K2HPO4（台湾联工化学制药厂，分析纯）。

1.2 仪器设备

旋转真空干燥仪（台湾泛群科技有限公司）;分析天平（美国丹佛DENVER，TB-214，精密度万分之一）;旋转蒸发仪（东京理化）;超声波清洗器（美国BRANSONIC，TB-214）;涡旋混合器（美国Scientific Industries，Vortex-Genie2）;紫外分光光度计（日立，U-1800）。

1.3 中药供试液制备

中药饮片高良姜、白及、白芷、苏木、白术、紫草、艾叶、马齿苋、诃子9味中药材购于台湾屏东大茂药局，由黄吉发教授进行性状鉴定，符合《中华人民共和国药典》[8]规定的基源。

称取10 g原药材置于250 mL三角瓶中，加入150 mL 70%药用乙醇浸泡12 h，在三角瓶口覆盖玻璃皿，文火加热45 min，将中药提取液抽滤，旋转蒸发仪浓缩，旋转真空干燥仪在50℃条件下干燥，制备供试中药提取物粉末。分析天平准确称取17 mg中药提取液干燥粉末，转移至10 mL容量瓶中，纯净水超声溶解并定容，制备成浓度为1.7 mg/mL的供试药液。

1.4 溶液配制

PBS缓冲液的配制（pH 6.8）：将0.5 mol/L的KH2PO4溶液53 mL与0.5 mol/L的K2HPO4溶液47 mL混合，向其中加入9 g的NaCl，并稀释至1000 mL既得0.05 mol/L pH 6.8的PBS缓冲液。

酪氨酸（181.2 g/mol）5 mmol/L溶液的配制：称取18.1 mg酪氨酸溶于20 mL pH 6.8的PBS缓冲溶液中，加热搅拌至透明。

酪氨酸酶溶液的配制：称取1.9 mg（10 000 U）酪氨酸酶，加10 mL浓度为0.05 mol/L的PBS溶液，避光冰浴下超声波震荡至透明，即得1000 U/mL酪氨酸酶溶液。

熊果苷供试液的配制：用PBS溶液配制熊果苷，浓度为4 mg/mL。

维生素C供试液的配制：用PBS溶液配制维生素C，浓度为4 mg/mL。

1.5 酪氨酸酶抑制测试

先将50 μL 5 mmol/L酪氨酸溶液和100 μL的中药水溶液混合置于96孔板。随后将以上混合溶液避光条件下加入20 μL 1000 U/mL酪氨酸酶溶液，25℃反应10 min（另外一组不加酪氨酸酶，而加入20 μL纯净水或者PBS缓冲溶液）。阳性对照组为熊果苷和维生素C，浓度均为4 mg/mL。纯净水为空白对照组。每个样品设置5个复孔。紫外分光光度计（日立，U-1800），波长为475 nm读取吸光度值。样品对酪氨酸酶的抑制率按照下式计算：抑制比率=[（A-B）-（C-D）]/（A-B）×100%;含酪氨酸酶与不含酪酸酶吸光度差值（△A）=C-D。A为纯净水加酪氨酸酶的吸光度（475 nm）数值;B为纯净水未加酪氨酸酶的吸光度（475nm）数值;C为加药样本加酪氨酸酶的吸光度（475 nm）数值;D为加药样本未加酪氨酸酶的吸光度（475 nm）数值。

2 结果

对照药维生素C对酪氨酸酶的抑制率为95.74%，阳性对照药物熊果苷的抑制率为46.34%，传统常用的美白中药白术、白及和白芷在本研究中抑制率分别为-6.46%、-3.76%和-7.51%。中药诃子的酪氨酸酶抑制率为51.43%。中药艾叶和马齿苋也有一定的抑制酪氨酸酶作用，抑制率分别为22.88 %和13.07%。而苏木的抑制率为-350.03%。见表1。

3 讨论

中医药关于美白中药的研究可谓历史悠久，在《神农本草经》中记载了多味美容美白中药，功效概括为“悦泽”“悦颜色”“好颜色”“去面黑干”“媚好”“美色”“润泽”“光泽”等，且言可做面脂。中医五行学说认为，白色属金，黑色属水，金生水，故面黑者可用白色中药入肺经间接达到补肾水之目的[9]，另外，中医讲究整体观念，通过活血化瘀，补气血等调节全身的阴阳气血，亦可达到美白的作用[10]。古籍记载白术可治疗面如雀卵色，用苦酒渍术，日日拭之，极效（《肘后方》）;白及可以除白癣疥虫，面上皯疮，令人肌滑（《名医别录》）。白芷可以长肌肤，润泽颜色，可作面脂（《神农本草经》）;艾叶可治疗面上皯黯（《本草纲目》）;马齿苋可治疗湿廯、白秃、杖疮（《本草纲目》）;陈藏器言高良姜可以下气益声，好颜色;紫草可以疗小儿疮，及面（《名医别录》）。现代研究发现紫草具有抗菌消炎、抗病毒等作用，在护肤品中应用广泛;苏木有活血破血之功，且现代研究发现，苏木有很好的抑菌活性。诃子又名诃黎勒，主治久泄久咳，有乌发生发之功，且有很好的抑菌功效。因此，本研究选择上述9味中药进行美白实验研究。

从研究结果可以看出，阳性对照药物维生素C对酪氨酸酶的抑制作用最强，高达95.74%，熊果苷的抑制率也达到46.34%，这与其他相关报道的实验结果类似[11-12]。虽然文献报道熊果苷和维生素C对酪氨酸酶的最大抑制率都可以超过90%，但在相同浓度下维生素C的抑制作用更强。本研究中，传统常用的美白中药白术、白及、白芷、紫草的抑制率出现了负值，提示几味药的醇提物对酪氨酸酶不但没有抑制作用，反而有促进作用。中药苏木的酪氨酸酶抑制率更是达到了-350.03%，这是由于苏木醇提物与体系中酪氨酸酶发生反应而产生沉淀，导致溶液浑浊所引起的。由于本研究中中药饮片采用70%乙醇提取，推测是由于乙醇提取的活性不如水提取导致的[13-14]。而且，提取温度对药物的活性也有影响，有研究显示[15]白芷随着提取温度的增加，抑制酪氨酸酶的作用会降低，甚至出现促进酪氨酸酶活性的作用。而陈美君等[12]却发现，白及醇提物对酪氨酸酶的抑制率可达68.36%，水提物却有促进酪氨酸酶作用，与本研究结果不同。中药诃子的酪氨酸酶抑制率高达51.43%，效果优于熊果苷，且诃子的实验浓度为1.7 mg/mL，要低于熊果苷的4 mg/mL。陈彬等[16]研究了5味酸味中药枳椇子、金樱子、木瓜、地榆、绿萼梅对酪氨酸酶的抑制活性，发现5味中藥都有很高的抑制率，其中枳椇子抑制率最高可达81.66%。陈志春等[17]考察了山楂、当归、山茱萸对酪氨酸酶活性抑制率、多巴色素自动氧化生成黑素量、多巴自动氧化抑制率，结果发现，酸味的收敛固涩药山茱萸对酪氨酸酶活性具有显著抑制作用（P < 0.05）。

诃子也是一味收敛固涩中药，在藏药中，诃子有“药中之王”的美誉，在敦煌古医书中有很多方剂用到了诃子。现代药理学研究显示[18-20]，诃子具有抗菌、抗氧化、降血糖、抗病毒、抗炎、保肝、抗肿瘤等功效。实验室前期研究发现[21]，诃子对八种常见的治病真菌和3种细菌均有不同层度的杀菌抑菌作用。可作为中药化妆品的重要原料进行深入开发。中药艾叶和马齿苋也有一定的抑制酪氨酸酶作用，也可作为美白成分进一步研究。酪氨酸酶抑制实验是美白活性成分筛选的经典实验，本研究设置了空白对照和阳性对照，结果稳定可靠。后续可以利用小鼠恶性黑色素瘤细胞模型评价所筛选的活性中药。

东方女性历来崇尚以白为美，当今很多男士也对美白不懈追求，因此，美白类产品层出不穷，成为了关注的热点。然而，在追求美白的同时，应避免副作用的发生，更要有一定治疗作用。由于痤疮、粉刺、脱发、龋齿等很大程度是微生物引起的，本研究考查了诃子、苏木、紫草等具有抑菌活性的中药的美白活性。将来可将美白药与抑菌中药组成复方并制成适宜的剂型，具有广阔的市场前景。

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