鼠巨细胞病毒感染小鼠胎盘病理学的改变对小鼠子代宫内生长发育情况的影响

龚琦 陈素华 马超

[摘要] 目的 觀察鼠巨细胞病毒（MCMV）感染小鼠胎盘病理学改变对子代宫内生长发育情况的影响。 方法 采用酶联免疫吸附法，在性成熟期小鼠中选取未感染MCMV的雌鼠，进行合笼受孕。采用随机数字表法将小鼠分为对照组与模型组，各8只。在孕龄12.5 d时，模型组透过胎盘进行MCMV悬液显微注射，对照组注射等量培养基溶液;在孕龄18.5 d时，断颈法处死雌鼠，观察98只胎鼠各个器组织标本病理改变。 结果 模型组胎盘感染率和胎仔感染率明显高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。有胎盘感染小鼠中胎仔感染率明显高于无胎盘感染者，差异有统计学意义（P < 0.05）;在有胎盘感染小鼠中，有细胞滋养细胞增生、合体细胞结节增生及纤维素样坏死者发生死胎和异常胎仔率明显高于无细胞滋养细胞增生、合体细胞结节增生及纤维素样坏死者，差异均有统计学意义（P < 0.05）;有纤维素样坏死者畸胎率明显高于无纤维素样坏死者，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 经胎盘感染MCMV是导致宫内感染的重要途径，MCMV感染是导致子代不良妊娠结局重要原因。

[关键词] 巨细胞病毒;小鼠;胎盘感染;病理学;生长发育

[中图分类号] R373.9          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）06（a）-0020-04

[Abstract] Objective To observe the efficacy of pathological placental changes after intrauterine murine cytomegalovirus （MCMV） infection on the intrauterine growth and development of fetal mice. Methods The mature mice without MCMV infection identified by enzyme-linked immunoabsorbent assay were served as the subjects. The male and the female mice were put into the same cage. According to the method of random number table， the mice were randomly divided into control group and model group， with 8 mice in each group. At day 12.5 of gestation， the placentas of the model group were injected with MCMV， while the control group was injected with cell maintenance medium. All female mice were executed at day 18.5 of gestation， and the change of tissues and organs of 98 fetal mice were observed. Results The placental infection rate and fetal infection rate in the model group were significantly higher than those in the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. In the placenta infection mice， the fetal infection rate increased significantly compared with those without placenta infection， the difference was statistically significant （P < 0.05）. In the placenta infection mice， the rates of stillbirths and abnormal fetuses in mice with cytotrophoblast proliferative， syncytial trophoblast nodules and fibrinoid necrosis were significance higher than those without cytotrophoblast proliferative， syncytial trophoblast nodules and fibrinoid necrosis， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The teratogenic rate in mice with fibrinoid necrosis was significantly higher than those without fibrinoid necrosis， the difference was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion The MCMV infection through placenta is an important approach for intrauterine infection. MCMV infection is an important cause of adverse pregnancy outcomes in offspring.

[Key words] Murine cytomegalovirus; Mice; Placental infection; Pathology; Growth and development

巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）具有潜伏期和再活化的生物学特性，可以导致终身感染[1]。人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）宫内感染对新生儿的出生结局产生严重影响[2]。孕妇感染HCMV会发生流产、早产、畸胎、死胎及神经系统发育落后等不良妊娠结局[3-5]。HCMV感染可改变胎盘组织结构[6]，从而影响胎盘功能及子代发育。

1 材料与方法

1.1 病毒

鼠巨细胞病毒（MCMV）Smith株购于中国典型培养物保藏中心（Chinese Center for Type Culture Collection，CCTCC），TCID50为104.55（即2.8×105）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立  于湖北省疾控中心购买SPF级BALB/c雌鼠和雄鼠各20只，均为90 d龄，体重（22±2）g，饲养于同济医院实验动物中心，实验动物使用许可证SYXK（鄂）2016-0057，实验动物合格证号：1394527。使用酶联免疫吸附法筛选未感染MCMV小鼠，方法参考说明书。将雌雄小鼠1∶1合笼，观察小鼠阴道，发现阴栓则为孕0 d。在孕12.5 d向对照组小鼠胎盘注射1 μL 3% FCS DMEM培养液;模型组小鼠胎盘注射1 μL MCMV上清，至少有1只胎鼠在孕鼠宫内保持5 d，即为建模成功[7]。

1.2.2 标本采集及处理  断颈法处死孕18.5 d雌鼠，将活胎鼠、死胎鼠（包括吸收胎）依次取出。观察胎鼠生长发育情况：取出活胎后，选取雌性胎鼠，用Sartorius BS系列精密电子天平称重，使用分规分别测量胎鼠的身长和体长[8]。采集胎鼠主要脏器和胎盘组织标本，用缓冲液冲洗碾磨制备匀浆，采用聚合酶链式反应法检测MCMV DNA[9]。胎盘MCMV DNA阳性判定为胎盘感染;胎仔任一脏器组织标本检测结果为阳性则视为胎仔感染。

1.2.3 主要试剂及仪器  DMEM培养基购买于美国Hyclone公司（SH30022.01B），胎牛血清均购买于Gibco公司（10270-106）;DNA提取试剂购买于德国QIAGEN公司（LOT：163020026）;酶联免疫吸附测定试剂盒从美国Trinity Biotech公司（IgM：904075;IgG：901389）购买，采用北京百晶生物技术有限公司BG-gdsAUTOTIO0型酶标仪（20620017020002）判断结果;引物交由上海生工生物工程公司合成[7]。

1.2.4 胎盘病理学检测  使用4%多聚甲醛固定标本，常规制作成石蜡切片（厚度4 μm）后显微镜检，观察绒毛组织的病理学变化。通过日本OLYMPUS BX50显微镜及HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统进行图像采集、编辑[10-11]。

1.3 统计学方法

采用SPSS 12.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验;计数资料用例数表示，组间比较采用χ2检验及Fisher直接概率法（双侧）检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胎盘感染与胎仔感染情况

模型组胎盘感染率（64%，32只）明显高于对照组（0%），差异有统计学意义（P < 0.05）。在所有98个标本中，模型组胎仔感染率（32%，16只）明显高于对照组（0%），差异有统计学意义（P < 0.05）。有胎盘感染的胎仔感染率（43.75%，14只）明显高于无感染者（3.00%，2只），差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.2 胎盘病理學改变对子代生长发育的影响

模型组胎盘镜下可见典型病毒包涵体，感染的胎盘内可见细胞滋养细胞增生、合体滋养细胞结节增生以及纤维素样坏死，见图1（封三）。在胎盘感染的小鼠中，有细胞滋养细胞增生、合体细胞结节增生及纤维素样坏死者发生死胎和异常胎仔率明显高于无细胞滋养细胞增生、合体细胞结节增生及纤维素样坏死者，差异均有统计学意义（P < 0.05）;胎盘是否存在细胞滋养细胞增生或合体细胞结节增生与其胎仔畸胎发生率差异无统计学意义（P > 0.05）;有纤维素样坏死者畸胎率明显高于无纤维素样坏死者，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1～3。

3 讨论

3.1 研究意义

关于妊娠期HCMV感染引起宫内传播机制尚不清楚。因此，有必要了解HCMV宫内传播机制，为疾病预防和治疗奠定基础。

HCMV经血透过胎盘感染是宫内感染的重要途径。HCMV感染后破坏胎盘淋巴管形成以及血管重构，阻碍人滋养层细胞祖细胞的发育，使绒毛生长停滞的在早期阶段，阻止其分化和融合为合胞滋养层细胞[11-12]。正常妊娠生理中胎盘绒毛直径减小从而扩大母胎间血氧交换表面积。绒毛内血管发生充血改变，细胞滋养细胞数量减少甚至消失。此时，妊娠晚期绒毛的主要结构和功能细胞就被合体滋养细胞所替代，并积聚形成多细胞结节。在部分细胞结节内可以观察到细胞核裂解消失，细胞浆厚度变薄，围绕绒毛血管周围，形成血管合体细胞膜，这种结构可以更好地促进母体与胎儿之间的气体交换。妊娠期内，蜕膜中血管也呈现适应性改变，更好地顺应胎儿生长发育，同时有利于孕产妇持续妊娠以及分娩[13]。当机体出现环境改变时，胎盘会发生一系列病理性改变，残存的绒毛出现间质水肿、淤血。胎盘蜕膜血管呈现出病理性改变，螺旋动脉血管管壁纤维化，管腔狭窄，导致母胎间物质交换受阻，影响胎儿发育[14-15]。

3.2 MCMV胎盘感染对子代感染的影响

本实验发现，小鼠感染MCMV的病理与人感染CMV相似。模型组胎盘镜下可见典型病毒包涵体，有胎盘感染子代MCMV的感染率明显提高，无胎盘感染时2只小鼠出现子代感染阳性，可能提示既往感染，现在病毒檢测已转阴。上述结论证实了经胎盘感染是导致宫内感染的重要途径。HCMV感染后可产生毒血症，病毒可直接损伤接触细胞引起宫内感染，造成宿主的多器官损伤[16]。HCMV病毒可以侵入胎盘滋养层，通过绒毛基质进入胎儿体内，引起宫内感染，使胎儿组织器官分化推迟或中断，出现生长发育异常情况[17]。

3.3 MCMV胎盘感染导致胎盘病理学改变对子代生长发育的影响

感染的胎盘内可见细胞滋养细胞增生、合体滋养细胞结节增生以及纤维素样坏死等病理改变，可对子代生长发育造成一定影响。合体细胞发生损伤引起细胞滋养细胞增生，是胎盘绒毛自身修复的表现;合体细胞结节增多通常是由胎盘绒毛缺血缺氧导致;而机体免疫复合物反应导致纤维素样坏死[18]。CMV感染胎盘后，介导机体发生免疫反应，导致部分绒毛发生病理改变，同时改变蜕膜细胞因子和趋化因子环境[19]，加重胎盘病理改变。CMV在胎盘中复制可导致细胞增殖和迁移失调[12]。Hamilton等[20]研究表明，单核细胞趋化蛋白-1和肿瘤坏死因子-α表达上调亦可对胎盘和胎儿造成损伤。

综上，本实验进一步验证了经血透过胎盘感染是MCMV感染的重要途径，MCMV感染可能是引起新生儿不良妊娠结局的重要原因。

[参考文献]

[1]  Davis NL，King CC，Kourtis AP. Cytomegalovirus infection in pregnancy [J]. Birth Defects Res，2017，109（5）：336-346.

[2]  Manicklal S，Emery VC，Lazzarotto T，et al. The “silent” global burden of congenital cytomegalovirus [J]. Clin Microbiol Rev，2013，26（1）：86-102.

[3]  姚丽，张梅，郭先成.孕妇巨细胞病毒感染载量与胎儿宫内感染的相关性分析[J].中华医院感染学杂志，2015，25（15）：3550-3552.

[4]  陈素华，闻良珍，凌霞珍，等.逆转录聚合酶链反应技术用于产前诊断人巨细胞病毒宫内活动性感染的临床价值[J].中华妇产科杂志，2002，37（10）：580-583.

[5]  游雪云，刘艳秋，徐永华，等.孕期人巨细胞病毒感染与不良妊娠结局的探讨[J].实验与检验医学，2019，37（3）：422-424.

[6]  Pereira L，Tabata T，Petitt M，et al. Congenital cytomegalovirus infection undermines early development and functions of the human placenta [J]. Placenta，2017，59 Suppl 1：S8-S16.

[7]  陈莉，陈素华，刘海智，等.经胎盘接种小鼠巨细胞病毒宫内感染模型建立[J].中国优生与遗传杂志，2006，14（3）：55-56，63.

[8]  陈主初，吴端生.实验动物学[M].长沙：湖南科学技术出版社，2003.

[9]  Sun XZ，Takahashi S，Fukui Y，et al. Neurogenesis of heterotopic gray matter in the brain of the microcephalic mouse [J]. J Neurosci Res，2001，66（6）：1083-1093.

[10]  唐敏一.胎盘病理学[M].北京：人民卫生出版社，1987.

[11] Tabata T，Petitt M，Zydek M，et al. Human cytomegalovirus infection interferes with the maintenance and differentiation of trophoblast progenitor cells of the human placenta [J]. J Virol，2015，89（9）：5134-5147.

[12]  Tabata T，Petitt M，Fang-Hoover J，et al. Cytomegalovirus Impairs Cytotrophoblast-Induced Lymphangiogenesis and Vascular Remodeling in an in Vivo Human Placentation Model [J]. Am J Pathol，2012，181（5）：1540-1559.

[13]  陈悦.巨细胞病毒的分子生物学研究现状与优生优育[J].中国优生与遗传杂志，2000，8（1）：113-115.

[14]  高霞.胎盘病理检查与妊娠期高血压疾病的相关研究[J].检验医学与临床，2013（20）：2684-2685.

[15]  马鸿达，王欣，赵天如，等.重度妊高征胎盘的形态计量学观察[J].中国实用妇科与产科杂志，1998，14（4）：221-223.

[16]  张雨，曾慧慧.人巨细胞病毒感染及母婴传播阻断临床研究进展[J].中华实验和临床感染病杂志：电子版，2017， 11（6）：526-532.

[17]  Lamarca HL，Nelson AB，Scandurro AB，et al. Human Cytomegalovirus-Induced Inhibition of Cytotrophoblast Invasion in a First Trimester Extravillous Cytotrophoblast Cell Line [J]. Placenta，2006，27（2-3）：137-147.

[18]  宋晓莹.胎盘病理检查与妊娠期高血压疾病的相关研究[J].健康大视野，2020（1）：250-251.

[19]  Emery VC，Lazzarotto T. Cytomegalovirus in pregnancy and the neonate [J]. F1000Res，2017，6（F1000 Faculty Rev）：138.

[20]  Hamilton ST，Gillian S，Zin N，et al. Human Cytomegalovirus-Induces Cytokine Changes in the Placenta with Implications for Adverse Pregnancy Outcomes [J]. PLoS One，2012，7（12）：e52899.

（收稿日期：2019-10-16  本文编辑：任  念）